变异链球菌在牙面的粘附、集聚是龋齿发生的先决条件，转基因可食防龋疫苗是通过基因工程技术，将变异链球菌中与龋齿发生密切相关的抗原基因（PAcA基因）转入植物的表达载体中，利用植物生物反应器生产的可食用基因工程疫苗．
（1）转基因植物的制备：
单一使用PAcA基因，机体免疫应答不理想，霍乱毒素中有增强机体免疫应答的氨基酸序列（CTB），将CTB基因与PAcA基因连接成嵌合（PAcA-CTB）基因，作为 ______ 与Ti质粒的T-DNA拼接，并用 ______ 法导入离体的黄瓜叶肉细胞中，经植物组织培养获得转基因植株．
（2）转基因植株目的基因的PCR鉴定：已知PAcA-CTB基因部分序列如下
5′---CCGTGT…ATGCCT---3′
3′---GGCACA…TACGGA---5′
根据上述序列选择引物 ______ （填字母）进行PCR．
A．引物：5′-GGCACA-3′
B．引物：5′-AGGCAT-3′
C．引物：5′-CCGUGU-3′
D．引物：5′-CCGTGT-3′
反应结束后，电泳检测PCR产物，结果如图（1来自未转化植株，2是含PAcA-CTB基因的质粒，3-10来自转基因植物），从结果可以看出， ______ 号植物含有PAcA-CTB基因．

（3）对上述含PAcA-CTB基因的植株进一步研究，发现其中一些植株体细胞中含两个PAcA-CTB基因（用字母A表示，基因间无累加效应）．为了确定这两个基因与染色体的位置关系，研究人员单独种植每株黄瓜，将同一植株上雄花花粉授到雌花柱头上，通过子一代表现型及其分离比进行分析：
①若F₁中疫苗植株：非疫苗植株= ______ ，则PAcA-CTB基因位于非同源染色体上，基因与染色体的位置关系如图甲所示．

②若F₁中疫苗植株：非疫苗植株=3：1，则两个基因位于 ______ ，请在图乙中标出基因．
③若F₁全为疫苗植株，则两个基因位于 ______ ，请在图丙中标出基因．
（4）上述三种基因与染色体的位置关系适于进行推广种植的是两个基因位于 ______ 的植株．多年后，若出现了非疫苗植株，请写出一种可能的变异类型及产生的原因 ______ ．

【考点】基因工程的操作程序，PCR技术

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