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  • 研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素,它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法,请分析回答下列问题。


    (1)从肝细胞中分离出相应的RNA,经________法,获得内皮抑素基因,再经________过程进行扩增,以获得更多的目的基因。

    (2)扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切,然后用DNA连接酶进行连接,构建重组质粒。双酶切不仅能避免了目的基因与载体的自身环化以及________连接,还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接,提高了重组质粒的比例。

    (3)大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因,LacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶,当培养基中含有IPTG和X—-gal时,X-—gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色,大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之,则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外,还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落,原因是_________________________。

    (4)从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养,获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板,37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中,72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目,实验结果如下表所示。实验结果说明_______________________________________________________________。

    粗提表达产物浓度/(μg·mL-1)

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    活的内皮细胞数目(×102)

    12

    6

    2

    1

    0.5

    0.5

    【考点】基因工程的原理,基因工程的操作程序
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    难度:较难
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