苦马豆素(SW)最早是从植物灰苦马豆中分离获得,为了研究SW是否具有抑制肿瘤细胞生长的作用,学者做了大量研究,相关实验过程及结果如下:

① 取小鼠肝癌Hepal-6细胞;

② 制成单细胞悬液,等量接种于多孔板,加入等量细胞培养液,每组设5个平行孔;

③ 于37℃、5%CO₂培养箱中培养24 h;

④ 加入等量不同浓度的SW溶液,于37℃、5%CO₂培养箱中培养;

⑤ 分别在24 h、48 h、72 h时摇匀后吸取培养液,观察并记录结果,得到不同浓度的SW对细胞存活率的影响曲线,如图所示;

⑥ 将培养48h的培养液离心,细胞染色,在荧光显微镜下观察拍照,记录癌细胞和凋亡细胞的数目,并采用免疫荧光细胞技术检测细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达量状况,汇总统计结果见下表。

培养48h后细胞数目及凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达水平

注:“+”的数量表示相对值的大小。

请回答下列问题:

(1) 实验中进行小鼠肝癌Hepal-6细胞培养的原理是____。培养箱中要有适量的无菌空气,原因是______________。肝癌细胞数量增多扩展时,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物,可能的原因是________。 

(2) 实验步骤③中“于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h”的目的是____________。 

(3) 分析图中曲线可知,SW对肝癌Hepal-6细胞的作用效果是____________________________________________。 

(4) 表中结果表明SW可以诱发细胞____,从而抑制肿瘤细胞生长。从两种蛋白质的表达水平来看,Bax蛋白和Bcl-2蛋白对癌细胞凋亡的作用分别是________。 

BAK基因是近年来发现的一种促凋亡基因，癌细胞内的BAK基因表达异常。将体外扩增的BAK基因导入癌细胞，有望成为癌症治疗的新途径。请分析回答：

(1)正常细胞生命历程包括________等过程，细胞凋亡是由________所决定的细胞自动结束生命的过程。

(2)癌变是在致癌因子的作用下，细胞内的________发生了突变而导致的。在癌变细胞内，BAK基因的表达水平明显________。

(3)实验小组为验证导入BAK基因在胃癌细胞中大量表达对胃癌细胞产生的影响，进行如下操作，并得到如图的结果，请补充完整实验步骤。

①用胰蛋白酶处理胃癌组织使之分散成单个细胞；

②将分散的单个细胞，等量分为甲、乙、丙三组，甲组细胞________，向乙组细胞中导入不携带BAK基因的载体，向丙组细胞导入________；

③在相同且适宜的条件下培养5d，统计各组活细胞数，并从分子水平上比较BAK蛋白的含量。

实验结果：丙组细胞数明显少于甲组和乙组，原因是________。

细胞周期失控是癌症的一个标志性特征，细胞周期素依赖性激酶(CDK)4和6是细胞周期的关键调节因子，CDK4／6在许多细胞中均过度活跃，导致细胞增殖失控。在雌激素受体阳性乳腺癌中，CDK4／6的过度活跃也非常频繁。I brance是一种口服CDK4／6抑制剂。为了验证I brance对乳腺癌细胞体外生长的作用，请根据以下提供的实验材料，完善实验思路，并回答以下问题。

    说明：细胞的数量通过测定相应培养瓶的吸光度值表示，具体操作过程不做要求；细胞抑制率＝(1－实验组吸光度值／对照组吸光度值)；CDK4／6活性可用抗原抗体法进行检测，具体检测过程不做要求。

    材料和用具：细胞培养瓶、乳腺癌细胞(MCF－7)悬液、乳腺癌细胞培养液、MTT仪器(测定细胞培养液的吸光度)、不同浓度的I brance溶液(用生理盐水配制)、生理盐水、CDK4／6活性检测试剂

    (1)实验思路：

    实验结果：①实验组细胞的抑制率高于对照组，在三组实验组中，I brance浓度越高抑制率越大。

    ②CDK4／6活性在对照组中最高，在三组实验组中，I brance浓度越高CDK4／6活性越低。

    (2)根据(1)中的思路和结果，设计一张表格用以记录实验结果。

    (3)研究发现实验组处于细胞周期S期细胞的比例均显著减小，且随着药物剂量增加，S期细胞的比例减少，由此推测CDK4／6在细胞周期中的作用机理是________________。虽然药物I brance抑制乳腺癌细胞的生长十分有效，但在后期的临床研究中，发现其也可引起患者中性粒细胞数目显著下降，根据这一结果，推测其可能影响免疫系统的第________________(选填“一”“二”或“三”)道防线。

近期统计数据显示,癌症已成为我国城市居民的首要死因。请回答问题。

(1)体外分别培养某种癌细胞和正常体细胞,上图中代表癌细胞生长曲线的是             。在体内,癌细胞可能侵袭周围正常组织,说明癌细胞具有                 的特性。 

(2)端粒酶是与染色体末端结构相关的一种细胞组分。表中数据显示细胞癌变可能与端粒酶的活性有关,请完成下面的探究实验。

实验目的:研究端粒酶与细胞癌变的关系。

实验材料:癌细胞,端粒酶抑制剂,细胞培养液等。

实验步骤:

①                                                                                                         ; 

②                                                                                                         ; 

③                                                                                                          。 

结果预测及分析:若                     ,说明端粒酶的活性与细胞癌变有关;若 ,说明端粒酶的活性与细胞癌变无关。 

(3)请根据上述内容,提出一种治疗癌症的新思路:                                                      。 

细胞培养已经成为生物化学、医学、制药等领域研究和生产不可缺少的技术。回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_________。

(2)在动物细胞培养过程中，首先要保证无菌、无毒的环境，对培养液要进行无菌处理外，通常还要在细胞培养液中添加一定量的__________，作用是__________________。动物细胞培养还需要的其他条件是___________、____________、____________。

(3)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现____________________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成________细胞，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面的糖蛋白的量________。

(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。

请回答与实验有关的问题：

   某同学从资料获知，二氯二乙胺能抑制癌细胞的增殖，并设计了如下实验加以验证，请根据实验方案回答问题。

   实验材料：二氯二乙胺溶液，蒸馏水，生理盐水，细胞培养液（内有小鼠肝部肿瘤细胞），试管等。

   实验的主要步骤如下表所示：

结论：第一，                                                ；

     第二，                                                。

①________________________________________________________________________________。

（3）设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率：

①将表中前48小时的数据转化为相应给药组细胞增殖率随时间变化的柱形图。

②通过数据和柱形图分析可以得出蜂毒素对人肝癌细胞的作用效果的特点是：______________________________________________________________________________．

（4）顺铂是一种DNA损伤药物，也是目前临床上多种癌症化疗的首选药物．若要探究蜂毒素联合顺铂对肝癌细胞生长的影响，应还需设置_____________ 给药组才能得出结论．

某同学从资料获知，二氯二乙胺能抑制癌细胞的增殖，并设计了如下实验加以验证，请根据实验方案回答问题。

［实验材料］已配制的不同浓度的二氯二乙胺溶液，蒸馏水，生理盐水，细胞培养液（内有小鼠肝部肿瘤细胞，并含有细胞所需的全部营养物质），试管等。

［实验的主要步骤］

Ⅴ.统计分析处理实验数据。

（2）进行实验，结果如下：

第一，________________________________________         

第二，____________________________________________

为研究药物二甲双胍、TRAIL在抗人膀胱癌中的作用，科研人员取适量人膀胱癌细胞进行了以下实验。

(1)细胞癌变后，细胞周期将变_____(填“长”或“短”)。

(2)研究表明：有氧情况下，癌细胞从内环境吸收并用于细胞呼吸的葡萄糖是正常细胞的若干倍，但产生的ATP总量无明显差异。这说明：

①癌细胞内的_______基因的结构发生了改变并被激活，进而改变了代谢途径。

②与正常细胞相比，癌细胞的______(填“有氧”或“无氧”)呼吸加强。

(3)若要单独研究二甲双胍的作用，应将人膀胱癌细胞随机分为两组，A组每天腹腔注射用生理盐水配制的二甲双胍溶液，B组注射______，连续给药48h，每隔2h记录癌细胞数量。

①由图分析，两种癌细胞中对TRAIL高度抵抗的是_________，判断依据是_________。

②实验结果表明，联合用药比单独用药对253J细胞的增殖_________。

③根据药物对两种癌细胞的不同作用效果，推测二甲双胍对TRAIL抗癌起辅助作用的前提是_________。

骨肉瘤是最常见的恶性成骨性肿瘤之一。科研人员研究曲古抑菌A（TSA）对人骨肉瘤细胞凋亡的影响及作用机制，为临床治疗寻找新方向。实验过程如下：

步骤1 用含青霉素和链霉素的高糖培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中培养人骨肉瘤细胞一段时间。

步骤2 取适宜浓度的处于生长旺盛期的人类骨肉瘤细胞，用加入不同浓度的TSA（0～200 ng·mL^-1）的培养基继续培养24h。

步骤3 对各组细胞进行抽样检测，检测方法是先用台盼蓝试剂（一种细胞活性染料）染色再用血细胞计数板计数，统计细胞存活率（未染色细胞数/细胞总数×100%），结果如图1。

步骤4 分别提取TSA浓度为0 ng·mL^-1、25 ng·mL^-1、50 ng·mL^-1处理的3组细胞，测量细胞中与凋亡相关的基因（Bax、Bcl-2）和β-肌动蛋白基因（不同的组织细胞中表达相对恒定）表达的蛋白质量并计算比值，结果如图2。分析回答：

（1）与正常成骨细胞相比，骨肉瘤细胞容易在体内分散和转移，其主要原因是                            。高糖培养基中加入青霉素和链霉素的目的是                     ，细胞培养箱中保持5% CO₂的作用是                  。

（2）步骤2中，设置0 ng·mL^-1 TSA实验的主要目的是                         。

（3）用台盼蓝试剂检测细胞活性的主要原理是                                  。

（4）图1所示结果表明                                  。

（5）根据图2判断，骨肉瘤细胞中          基因过度表达会加速细胞凋亡。