选修1：生物技术实践]

 临床试用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。                           

回答下列问题：

（1） 为了从样本中获取致病菌菌落，可用_______法或_________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

（2） 取该单菌落适当稀释，用______法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。

（3） 为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A，B，C，D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_______（填“敏感”或“不敏感”）；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_____（填“敏感”或“不敏感”）；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。

(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选择抗生素_______。

下图表示微生物的接种实验中的一些步骤。请回答下列有关问题。

①把接种工具燃烧至变红②将接种工具在火焰旁边冷却③接种

（1）图中接种工具的名称是____________，制备培养微生物的培养时，灭菌与调pH的先后顺序是________。

（2）步骤②中，将接种工具冷却的原因是____________。

（3）步骤③中，将接种工具灼烧____________次

（4）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。

①小明纯化菌种的接种方法为________，该方法不仅可以进行纯化，还可以进行____________

②采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1~5号比色管的苯酚浓度应分别为____________。

如果废水为100mg/L苯酚溶液，降解后约有25%的苯酚残留，则需将残留液稀释____________（填序号：①10②20③30）倍后，再进行比色。

为探究大肠杆菌CV101菌株和CV103菌株的营养需求，某团队在营养成分相同的含醋酸盐的培养液中分别接种CV101菌株和CV103菌株，并置于相同且适宜的环境中培养，每隔一段时间统计两种菌株的生长状况。实验数据如下图所示，回答下列问题：

（1）醋酸盐培养基从物理性质上来看属于________培养基，该培养基主要应用是________；从功能上来看属于________培养基。

（2）由图可知：更适应醋酸盐培养基环境的菌株是________，其依据是________。

（3）若要统计培养30小时后醋酸盐培养基中的CV101活菌数，为保证能在固体培养基上获得单个菌落，接种前，需取1mL该菌液进行________处理。

有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：

(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于________培养基。

(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________________和______________。接种时所用的接种环通过________灭菌，在第二次及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，该分离纯化方法称________法。

(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。

(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、____________和____________________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。

（2）若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是 _________ ．对分离的细菌数目统计时，统计的菌落数目往往比活菌的实际数目偏少，原因是_________________________ 。

（3）在实验室应采用___________法对培养基进行灭菌处理，在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在_____________条件下进行．若发现在⑤中菌落过多，无法准确计数，可以将③中取出的菌液_____________________________ ．

Ｉ下图表示单克隆抗体制备过程示意图。据图回答：

（1）淋巴细胞是由动物体骨髓中的造血干细胞分化、发育而来得到，B淋巴细胞从小白鼠体内分离之前,应对小白鼠进行的处理是_________________ ,该处理的实质是在小白鼠体内发生_____________过程。骨髓瘤细胞与进行原代培养的细胞相比较,遗传物质发生的主要变化是___________,从而违背了“程序性细胞死亡”规则,打破了细胞产生与细胞死亡的动态平衡。

（2）____________________技术是单克隆抗体技术的基础，根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于__________培养基，试设想运用生物工程其它领域的技术制备单克隆抗体的另一条途径________________ 。

（3）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的_______________特点，又具备B淋巴胞的_______特点。单克隆抗体与常规的血清抗体相比 ，最大的优越性是_______________，_______________。                                            

II绿色荧光蛋白(GFP)能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，GFP基因可作为目的基因用于培育绿色荧光小鼠，下图表示培育绿色荧光小鼠的基本流程：

（1）①过程需要限制酶切断________________键，使DNA分子断裂，其结果形成_____________。图中过程②常用的方法是_____________ ；过程③利用的生物技术主要是___________________；在进行过程④前，利用______________技术可以获得数目更多且基因型相同的绿色荧光小鼠。

（2）GFP基因与目的基因一起构建到载体上不影响目的基因的表达，也不影响由目的基因控制合成的蛋白质的结构与功能,且对细胞无毒性作用，因此GFP基因可以作为基因表达载体上_____________。

（3）获取外源基因若需在短时间内获得大量的某种外源基因，通常采用 _________ 技术．在供体雌鼠发情周期的某一阶段，用______激素处理促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，称为超数排卵．在让供体母鼠与健康公鼠交配的同时，让代孕母鼠与结扎公鼠进行交配，使代孕母鼠与供体母鼠的生理条件达到同步或者一致，称为 __________ 处理．将目的基因导入受体细胞后，还需对转基因生物进行_________________。

氟乐灵（C₁₃H₁₆F₃N₃0₄）是播种前封杀棉田中一年生杂草的主要农药之一。氟乐灵残留大多聚集在土壤深度10～20cm，容易造成表层土壤的持续污染。为降低土壤中氟乐灵的残留，某科研团队从连作15年的棉田分离出了对氟乐灵有良好降解作用的菌株D8，并对其降解特性进行了一系列的研究。图1～3是部分研究成果，图中数据均为接种72h后测得，OD₆₀₀表示菌种在波长600nm处的吸光值，代表菌密度。请回答下列问题：

（1）土壤取样时，一般采集深度选择在10～20cm，原因是      。

（2）为分离出氟乐灵降解菌，研究人员配制了选择培养基，该培养基应以氟乐灵为唯一的     以达到分离目的。

（3）对氟乐灵降解菌D8进行分离和计数常用稀释涂布平板法，此方法测得的菌落数往往比活菌的实际数目偏      ，原因是     。

（4）分析图1可知，接种量对菌密度和降解率影响分别是     。

（5）据图2分析，在氟乐灵质量浓度较高的情况下，降解率反而较低，原因是      。

（6）图3研究过程中，为了排除PH对氟乐灵降解的影响，需设置对照，对照组的处理方式是    ，结合图1、2、3分析，菌株D8对氟乐灵进行降解的最佳条件组合是    。

回答下列微生物及其培养问题

　　农业上广泛使用的除草剂在土壤中不易被分解，长期使用会污染土壤。为了修复被污染的土壤，可按下图程序选育出能降解该除草剂的细菌。（注：已知该除草剂是一种含氮有机物；含一定量该除草剂的培养基不透明。）

（1）微生物培养过程中需要的营养物质主要有_________________。由于不同种类微生物的菌落特征表现不同，因此可以利用__________（填“固体”或“液体”）培养基来培养，通过观察菌落特征对微生物进行初步的鉴定和分类。

（2）培养基的配制主要包括如下步骤：①溶化，②调pH，③高温高压灭菌，④称量。这些步骤正确的顺序是__________。（填编号）

（3）实验中进行平板划线操作（如图乙、丙所示）的目的是__________。在具体操作时，首先要将接种环通过（填编号）__________（①紫外线；②酒精灯灼烧；③高压蒸汽）灭菌；第二次及以后的划线，总是从__________开始。

（4）为了选育出能降解除草剂的细菌，在配制培养基时需添加一定量的该除草剂，其原因是____________________。

（5）为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿__________培养。在培养基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为__________。

（6）如果筛选能降解该除草剂的细菌结果如图丁所示（A~E分别表示不同的菌株），其中的B、D菌株周围无透明圈形成，说明____________________；如果从A~E菌株中选育高效的能降解该型除草剂的细菌，应选育菌株__________。

（7）为探究此除草剂的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图戊所示实验。该实验的假设是目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质；该实验设计缺少对照处理，正确的对照处理是__________________。

葡萄种植基地为解决葡萄滞销易腐烂问题，引进果酒、果醋生产线进行葡萄的深加工，获得了较好效益，其菌种筛选和生产流程如图所示。其中在纯化菌种A时，共接种了甲、乙、丙、丁、戊五个平板，每个平板接种量均为O.lmL。纯化菌种B釆用的是划线接种。请回答下列问题：

（1）候选菌种A和B在细胞结构上的最大差别是菌种A有              。图中筛选菌种所用的培养基在灭菌时温度为                。

（2）纯化菌种A时，乙平板的菌落分布如上图所示，则纯化菌种A的接种方法为                    ，接种乙平板时的操作失误是                  。

（3）纯化菌种A的过程中，除乙平板外，其余的甲、丙、丁、戊平板的菌落数分别是180、 200、420、190，则样品中菌种A的密度为       个/mL，此方法计数的结果常常低于实际值，原因是                           。

（4）果醋发酵与果酒发酵相比，提供的不同条件有                          。

（1）若要从土壤中分离出能分解植物秸秆的微生物，培养基中的碳源是__________，对该培养基可采取__________的方法进行灭菌。

（2）某同学对分离得到的微生物培养液进行数量测定，在稀释倍数为10⁵对应的培养基中测定平板上菌落数的平均值为23.4，则每毫升样品中的细菌数是（涂布平板时稀释液的体积为0.2 mL）__________。

（3）用上述方法测定目的菌的密度，实际活菌数量要比测得的菌落数量多，原因是________________。

（4）上述流程图中，糖液发酵产生酒精需要的菌种是________________，酒精是在目的菌的_______________（结构）中产生的。

（1）为获取抗盐基因，可以从碱蓬细胞研磨液中提取抗盐基因的________来合成cDNA。

（2）上图构建基因表达载体时，最好选用__________________        __________酶切割含目的基因的外源DNA和质粒，不能使用Sma Ⅰ切割的原因是_________________________________________。构建好的重组质粒在抗盐基因前要加上特殊的启动子，启动子是一段有特殊结构的________片段。

（3）将基因表达载体导入农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA上的原因是________________________________。通过农杆菌的转化作用，使抗盐基因插入到马铃薯细胞中的染色体DNA上，从而使抗盐基因的遗传特性得以______________________________________。

（4）上图转基因抗盐马铃薯培育过程中，属于脱分化阶段的是________（填序号）。从个体水平上检验转基因抗盐马铃薯是否培育成功的方法是______________________________________________________。

普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α－淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。

(1)图甲中，过程①需要的酶有____________________________________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以________作为唯一碳源。②、③过程需重复几次，目的是________________________________________。

(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是______________________；推测该同学接种时可能的操作失误是_________________________。

(3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种__________________菌的发酵罐需要先排气，其原因是_______________________________。