编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：

(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTC—T……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋向乙，原因是____________________________________________________。

(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为__________，加入了________作为合成DNA的原料。

(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加人等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。

①如图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是______。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO₂浓度，CO₂的作用是______。

②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

(1)图示过程涉及的生物技术有_____________________、____________________。

(2)构建的基因表达载体除含有人抗体基因、标记基因外，还应具有________、________。

(3)向转基因小鼠注射特定的抗原后，从小鼠的____________中提取B淋巴细胞；细胞X是____________，体外培养细胞X所用的培养液必须添加____________________等天然成分。

科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图，请回答相关问题：

（1）过程①获得重组胚胎之前需要通过__________________技术获得重组细胞，接受细胞核的去核卵母细胞应该处于___________________时期。

（2）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其_______________分离出ES细胞。步骤③中，需要构建含有干扰素基因的__________________。

（3）将基因导入ES细胞常用的方法是________________________。体外诱导ES细胞向不同方向分化是利用了ES细胞的_________________。

（4）为检测干扰素基因的表达情况，可采用__________________方法，若有杂交带出现，表明目的基因已成功表达。

根据下面植物体细胞杂交技术流程图，回答相关问题

（1）运用传统有性杂交(即用番茄、马铃薯杂交)自然状态下不能得到杂种植株，原因是______________________________________________________

（2）在利用杂种细胞培育杂种植株的过程中，依据的原理是____________，其中过程②称为____________，植物体细胞融合完成的标志是___________。

（3）已知番茄、马铃薯都为四倍体，则“番茄—马铃薯”属于________倍体植株。

（4）已知柴油树种子含有的柴油是植物细胞的代谢产物，可用植物组织培养来实现柴油的工业化生产。若利用此技术，将柴油树细胞培养进行到________过程即可(填字母编号)。

（5）若培育抗虫棉，将抗虫基因通过适当的途径导入棉花受精卵，然后进行组织培养，该过程相当于________(填字母编号)。

（6）人工种子是由发育到________过程(填字母编号)的结构包裹上人工种皮制备的。

下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素（由人垂体细胞产生的一种蛋白质类激素）的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶pstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切点各一个，且三种酶切割形成的黏性末端各不相同，而Amp^r表示青霉素抗性基因，Tet^r表示四环素抗性基因。请据图回答以下相关问题：

（1）过程①所用细胞是________________，过程②所用的酶分别是___________________。

（2）人生长激素基因在经③处理之前需经过PCR扩增，扩增时应在PCR扩增仪中加入_______________________酶用以催化互补链的合成。

（3）过程④所用的酶是___________________________。

（4）若用限制酶PstⅠ切割，完成过程④、⑤后，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，再将甲培养基上的单个大肠杆菌接种到丙培养基上，待形成12个菌落后，将相应菌落的一部分转接到乙培养基的相同位置上。一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到培养基乙上能存活的是导入含_____________质粒的大肠杆菌。生产人生长激素的工程菌应从丙培养基的菌落中选取，选取的依据是_____________________。

基因工程制药是制药行业的一支新军,不仅具有独特的优势,发展速度也很快,下图是应用基因工程构建疱疹病毒亚单位疫苗的方法,请根据图示回答下列问题:

(1) 提取单纯疱疹病毒DNA后用____酶切取____基因作为目的基因,获取目的基因后,要用______对其进行扩增。 

(2) 首先,要已知目的基因的________,以便人工合成引物。将过量的引物与目的基因混合,加热到____℃,使双链DNA解旋成单链,之后冷却到5560 ℃,引物与DNA单链结合,下一步,加入____和4种脱氧核苷酸,升高温度至7075 ℃后,完成互补链的合成,如此重复循环多次,直到产生足够供实验用的目的基因。 

(3) 提取并剪切牛痘DNA,使其与目的基因连接成重组DNA后,在____中培养一段时间后,分离出无害的病毒(疫苗),它含有与______相同的外壳。 

(4) 将分离出的疫苗注射到人体内,激活人体的____免疫,产生抗体和记忆细胞。 

用小鼠进行DNA重组研究中形成的“基因敲除”技术，能“敲除”DNA分子上的特定基因。该技术的主要过程如下：

第一步：分离小鼠胚胎干细胞，这些细胞中含有需要改造的基因，称“靶基因”。

第二步：获取与“靶基因”同源的DNA片段，利用特定技术在该DNA片段上插入neo^R基因（新霉素抗性基因）成为突变DNA（如图），使该片段上的靶基因失活。

第三步：将插入neo^R基因（新霉素抗性基因）的靶基因转移入胚胎干细胞，再通过同源互换，用失活靶基因取代两个正常靶基因中的一个，完成对胚胎干细胞的基因改造。

第四步：将第三步处理后的胚胎干细胞，转移到特定培养基中筛选培养。

其基本原理如下图所示：

（1）第二步中neo^R基因插入靶基因使用的工具酶是________。neo^R基因不仅能使靶基因失活，还是________；“靶基因失活”的含义是________________________________。

（2）从研究者成功获得如图所示的“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞，到将该细胞培育成“基因敲除”小鼠，运用到的生物技术有________、________、________等。

（3）科学家可以通过“基因敲除”技术来治疗疾病，上题中获得的基因敲除小鼠，能否直接用来研究基因功能并说明原因______

________________________________，______________________________________。

为了加快优良种牛的繁殖速度，科学家采用了以下两种方法，请根据图示回答下列问题。

(3)在受精的过程中，精子入卵后会立即发生一种反应叫_______反应，以防止多精入卵受精。判断卵子是否受精的标志通常是______________________。

(4)要培育高产奶率的转基因牛，如建立生产生长激素的乳腺生物反应器，科学家要将___________和乳腺蛋白基因的启动子、终止子重组在一起，通过显微注射等方法导入牛的受精卵中。受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。

(5)“试管牛”的形成用到的生物技术有____ (填序号)

①早期胚胎培养   ②体外受精   ③胚胎移植   ④核移植

(6)早期胚胎中的胚胎干细胞，不仅可以应用于哺乳动物胚胎性别鉴定，还可应用于治疗人类的某些疾病，如老年痴呆症、糖尿病等； ES细胞体外诱导分化培育出人造组织器官用于_______、研究体外细胞分化等领域。 

下图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病（基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素）的过程设计图解，请据图回答：

（1）图中①、③所示的结构分别是__________、__________。

（2）图中②、④所示的生物工程技术分别是__________、______

__________。

（3）过程④通常用③做受体细胞的原因是③细胞__________。

（4）过程④的完成需要用到的基因操作工具有__________。

（5）图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是__________

__________。

请回答：

(1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，__________(需要/不需要)启动子。

(2)步骤②中，用Ca^2＋处理大肠杆菌，使之成为__________细胞，然后导入重组载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有__________________基因。

(3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X－gal的培养基上会形成蓝色菌落，易于识别。根据上述原理可以初步判断__________(蓝色/白色)菌落中的大肠杆菌为重组菌。

(4)将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与______________________形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。