科研人员从一些荒漠植物中成功克隆抗旱功能基因培育出抗旱耐盐碱和耐贫瘠能力明显的转基因紫花苜蓿新品系，它的研究成功对改良与利用大面积盐荒地、改善生态环境以及促进农牧业可持续发展具有现实意义。结合所学知识回答下列问题：

（1） 题目中的“克隆”最常用的是指_________技术，其原理为______________________。

（2）基因表达载体构建时目的基因的两端必须有______________________。

（3）紫花苜蓿为双子叶植物，常用的导入目的基因的方法是_______________。

（4）采用__________技术检测转基因植物的__________上是否插入了目的基因，同时还要采用__________技术检测目的基因是否在转基因植物细胞中表达。若进行个体水平的检测，需将该植株栽培于_________________________环境中，以观察其生长状况。

科学家利用PCR技术分别从抗根结线虫的番茄和辣椒中克隆抗性基因SIMi及CaMi，并利用遗传转化方法将它们转入对根结线虫敏感的番茄中，获得抗根结线虫的番茄转基因株系应用于植物抗根结线虫育种。请回答相关问题：

(1)PCR技术是扩增目的基因的常用手段。扩增过程中，目的基因DNA________后解旋为单链，__________与单链相应互补序列结合，在酶的作用下进行延伸。

(2)________________是实施基因工程的核心。

(3)将目的基因转入对根结线虫敏感的番茄中，最常用的方法是____________。通过转化，目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____________________。

(4)为了检测对根结线虫敏感的番茄中是否插入目的基因，可采用______________技术。检测目的基因在分子层面是否表达则可以用___________________的方法。

(5)为了比较两种抗性基因(SIMi和CaMi)在转基因后的抗根结线虫的效果，可分别取等量的两种成功表达的转基因番茄植株____________，比较其抗虫效果。

预防乙肝最有效的途径是接种疫苗。将乙肝表面抗原基因转移到植物细胞内可生产乙肝疫苗。回答下列问题。

    (1)欲在短时间内大量扩增乙肝表面抗原基因，可利用___________________(填写中文名称)技术，其原理是______________。利用该技术扩增乙肝表面抗原基因的前提是______________。

    (2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，此外采用________________法十分简便经济。用抗原一抗体杂交技术检测植物细胞是否成功合成乙肝表面抗原蛋白。若有__________出现，表明目的基因已控制合成蛋白质产品。

    (3)将乙肝表面抗原基因导入植物细胞后，采用______________技术获得愈伤组织，该技术需在_____________条件下进行。

    (4)乙肝疫苗在2～8℃条件下保存，其不宜在常温下保存最可能的原因是_____________________。

(2) 图中过程(2)是基因工程的第二步，即：                            。

(3) 图中过程(3)是用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒感染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用       处理，使细胞处于能吸收外源DNA的生理状态，这种细胞称为__________细胞，再与溶于缓冲液的表达载体混合，在一定的温度下完成转化。

(4)检测大肠杆菌B是否导入了质粒或重组质粒，可采用的方法是将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A或重组质粒，反之则没有导入。因为普通质粒A和重组质粒上都有                        。

(5)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，出现的现象是有的能生长，有的不能生长。其中导入             的细菌不能生长。

(6)应用___________________杂交技术可检测工程菌是否表达出人的生长激素。

干扰素是动物或人体细胞受病毒感染后产生的一类糖蛋白，具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。回答下列问题：

(1)干扰素的作用机理是：干扰素作用于宿主细胞膜上的相应受体，激活细胞核中基因表达产生多种抗病毒蛋白，其中有些蛋白可通过激活____________使病毒的RNA水解；有些则可与__________(细胞器)结合，通过抑制病毒多肽链的合成发挥抗病毒作用。

(2)利用基因工程产生干扰素的方法之一：利用________酶将干扰素基因与牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件连接在一起构建基因表达载体，采用__________的方法导入牛的受精卵细胞中，经胚胎早期培养至________________期，移植入母体内发育成熟，即可获得能产生干扰素的转基因牛。

(3)由于干扰素在体外保存困难，可利用蛋白质工程对干扰素进行改造，基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

基因工程的整个过程包括工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分。回答有关问题：

（1）基因工程操作中需要使用的工具酶是                            。

（2）基因工程中将外源基因（例如抗除草剂基因）导入受体细胞（例如玉米）中的运载体包括                   （写出2种），运载体必须具备的功能，除了能将外源基因转移到受体细胞中，还必须具备能为外源基因提供在受体细胞中的                  能力。

（3）农杆菌因具有含T-DNA（可转移的DNA）的Ti质粒备受青睐。能将目的基因导入受体细胞的重组Ti质粒又称为              ，其组成至少包括5个不可缺少的DNA序列：除目的基因、终止子外，还有                            （缺一不可）。

（4）获得目的基因（抗除草剂基因）的方法有：以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是                            ；又可通过技术扩增目的基因；还可通过化学方法直接获得              。检测抗除草剂基因导入转基因生物细胞后，是否能稳定维持和表达其遗传特性的方法是                            。

完成下列相关填空

（一）某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其特性分析研究，其流程如下图所示。

（1）土壤悬液先经80℃处理15分钟，其目的是筛选出             。

（2）在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行            ，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。培养后观察到单菌落，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与           强弱相关。

（3）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中         的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高                的利用率。

（4）利用物理或化学方法将植酸酶固定在          的介质上称为固定化酶。实验过程涉及两次蒸馏水洗涤反应柱的操作，其中第一次洗涤的目的是除去             。

（二）下图为绵羊多莉克隆过程，请回答有关问题。

（5）步骤1中若要获得较多数量的卵细胞，通常对母羊注射相关激素使其超数排卵。步骤2可通过降低           浓度，实现对乳腺细胞的营养限制性培养，可以得到大量的          期细胞，从而实现细胞分裂同步化。

（6）步骤3中科研人员采用         技术进行细胞融合，步骤4通过胚胎体外培养获得胚胎，待发育至              胚胎时进行移植，通常移植至代孕母羊的          部位。

（7）若要将目的基因导入乳腺细胞中，在扩增目的基因时，除利用PCR技术外，还可将目的基因所在的重组载体导入大肠杆菌中，利用大肠杆菌  ▲ 使其扩增。

（8）为获得大量的上述克隆羊，可用胚胎成纤维细胞进行体细胞克隆。因为胚胎成纤维细胞可进行           培养，理论上可获得无限只克隆羊。

基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答： 

（1）图中A是______；在基因工程中，②拼接过程所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是____DNA连接酶。只能连接黏性末端的是_____DNA连接酶。 

（2）在上述基因工程的操作过程中，遵循碱基互补配对原则的步骤有_____。（用图解中序号表示） 

（3）将基因表达载体导入动物的受精卵中常用_____法。如果受体细胞是大肠杆菌，需要用____处理细胞，使之成为_____，才能吸收DNA分子。

（4）研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源可以看成是_____。 

（5）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明_____，若把目的基因导入该植物的叶绿体DNA中，则其产生的配子中____（填“一定”或“不一定”）含有该基因。

（6）假如用得到的二倍体转基因抗枯萎病植株自交，子代中抗病与不抗病植株的数量比为3：1时，则可推测该抗病基因整合到了____上（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。  

去年冬季我国北方再次爆发流感，专家指出接种流感病毒疫苗仍是预防的有效措施。流感病毒为RNA病毒，M基因编码流感病毒表面抗原（M蛋白）。请回答下列问题：

（1）由病毒RNA通过________________可获得病毒DNA，若要通过PCR技术扩增M基因，前提是设计M基因对应的_____________ 。

（2）构建M基因表达载体所用的工具酶是 ____________________ 。若要将M基因表达载体导入到大肠杆菌细胞内，以大量生产疫苗，通常先用钙离子处理大肠杆菌，其目的是 _______________________。检测M基因是否转录出mRNA的具体方法是使用__________________与提取出的______做分子杂交。

（3）新型疫苗—“DNA疫苗”是将含M基因的重组表达载体直接导入人体内，在人体细胞内通过M基因的表达产生__________，刺激机体通过免疫过程产生_________，以提高机体的免疫能力。