【生物—选修 现代生物技术】

凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中并使之表达。下图表示EcoRI、BamHI、PstI三种限制酶在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点。请回答下列问题：

（1）根据图中EcoRI、BamHI、PstI三种限制酶的切割位点分析，该工程中最不适宜用来切割外源DNA获取目的基因的限制酶是___________________________，原因是___________________________。将切割后的质粒和目的基因连接起来需要_______________________酶。构建好的重组质粒在目的基因前要加上特殊的启动子，它是___________________________识别和结合的部位。

（2）工业化生产过程中，若采用重组大肠杆菌生产凝乳酶，该过程中将目的基因导入大肠杆菌前，常常用___________________________处理细胞，使之处于一种能___________________________的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。

（3）研究发现，如果将该凝乳酶第20位和第24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。科学家可以生产上述高效凝乳酶的现代生物工程技术是___________________________。该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成，原因是___________________________。

(1)图中①～⑤所示的生物工程为________。该工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过对基因的________，对现有的基因进行改造，或制造出一种新的________，以满足人类生活的需求。

(2)图中序号④所示过程叫作________，该过程遵循的碱基互补配对原则不同于翻译过程的是________(请将模板碱基写在前)。

(3)若大量扩增目的基因，则用的是________(写出全称)技术，该过程需要的聚合酶的特点是________。

(4)若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产，则构建基因表达载体时，在基因的首端必须有________；且在图中⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含________性染色体的精子。

2008年诺贝尔化学奖授予了三位在研究绿色荧光蛋白（GFP）方面做出突出贡献的科学家。绿色荧光蛋白能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。下图为我国首例绿色荧光蛋白（GFP）转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：

注：图中通过过程①、②形成重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

（1）在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来       ，理由是：                                                                  。

（2）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多的方法是              。

（3）如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是          。获得的转基因克隆猪，可以解决的医学难题是，可以避免                。

（4）目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：      （用数字表示）。

①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸

②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列

③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）

④表达出蓝色荧光蛋白。

(1)转录的起始部位称为________，是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶________的部位。

(2)该基因来自________(填“基因组文库”或“cDNA文库”)，该文库包括该生物的________(填“全部”或“部分”)基因。

(3)翻译时与密码子发生碱基互补配对的是________上的反密码子，该物质的主要功能是________。

(4)基因工程在原则上只能产生________的蛋白质。蛋白质工程是以蛋白质分子的________及其与生物功能的关系作为基础。

(1).B是________过程。

(2).为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是_______________________。

(3).农杆菌中的Ti质粒上的T­DNA具有________________________________的特点。目的基因能否在棉株体内稳定遗传的关键是目的基因是否整合到植物细胞染色体的DNA上，可以用________________技术进行检测。

(4.)如果要想使该酶活性更高或具有更强的耐受性，需要对现有蛋白质进行改造，这要利用基因工程的延伸——蛋白质工程。首先要设计预期的蛋白质结构，再推测应有的氨基酸序列，找到相对应的___________。

据图回答：

（1）获取人乳铁蛋白基因：可构建          文库。构建该文库的第一步是从        细胞中提取           。

（2）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用限制酶BamH I 和        同时酶切载体和人乳铁蛋白基因,用两种酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因的优点是                       。

（3）重组质粒筛选方法是用经限制酶切割和DNA连接酶作用过的质粒转化大肠杆菌，先用含               的培养基进行培养，若能生长，再影印到含         的培养基上培养，若不能生长，说明该菌落的大肠杆菌导入的质粒是重组质粒。

（4）培育转基因牛时可用           法将重组质粒导入牛的受精卵中。在体外培育成早期胚胎后，再移植至代孕母牛的子宫中，在移植前某一段时间需给代孕母牛注射            激素。

（5）为检测人乳铁蛋白在牛乳腺中是否表达成功，采用的方法是                   。

疾病的诊断与治疗过程中，经常使用单克隆抗体。回答问题：

(1)单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，杂交瘤细胞具有的特点是________。体外培养杂交瘤细胞，首先应保证其处于________的环境，其次需要提供充足的营养和适宜的温度，培养箱中充入二氧化碳的作用是________。

(2)单克隆抗体在诊断疾病的方面上具有________的优点；在治疗癌症方面可制成________治疗癌症。

(3)科研工作者欲对单克隆抗体进行改造，生产出效果更好的嵌合抗体，用于治疗疾病。用蛋白质工程技术对单克隆抗体进行改造时，首先必须根据预期________，设计嵌合抗体的结构。最终通过基因拼接，将抗体基因改造成嵌合抗体基因，然后导入到淋巴细胞中表达。检测该基因在淋巴细胞中是否翻译成蛋白质．可使用________技术。

（1）目的基因可以从基因文库中直接获取，然后可以利用PCR技术扩增基因，PCR的原理是               ，利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成       。

（2）据图分析，在构建重组质粒的过程中，目的基因用                   （填“酶I”或者“酶II”）进行了切割。检验重组载体导入能否成功需要利用                      作为标记基因。检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法是      。

（3）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是     ，早期的基因工程操作都用         作为受体细胞。

（4）若希望通过转基因牛生产的胰岛素具有作用快、持续时间长等特点，则需要通过             工程手段对人的胰岛素基因进行设计，该工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→               →推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

（5）基因工程已经广泛应用于各个领域。目前，治疗遗传病的最有效的手段是      。

注：图中通过过程①、②形成重组质粒，限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

（1）在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接        ，理由是：                                  。

（2）如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是              。可以利用转基因克隆猪技术解决的医学难题是，在器官移植中可以避免                 。

（3）上述图中转基因克隆猪运用了基因工程、                 、          等生物技术。

（4）目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：          （用数字表示）。①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）④表达出蓝色荧光蛋白。