斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具体纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验：

（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，将重组质粒显微注射到斑马鱼_________中，整合到染色体上的G基因_________后，使胚胎发出绿色荧光。

（2）根据上述杂交实验推测

（3）杂交后，出现红·绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代_________（填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中__________发生了交换，导致染色体上的基因重组。

用已学基因工程相关知识，解决以下问题：

A：下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。

(1)  若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是

—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶_______________切割质粒，用限制酶_______________ 切割抗虫基因。①过程在___________(填“体内”或“体外”)进行。

B：多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶使细胞壁破损。成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如下图。据图回答下列问题：

(1)若已获取PG的mRNA，可通过____________方法获取PG基因。PCR技术扩增目的基因的前提是_______________，以便根据这一序列合成引物。

(2)该质粒含14000碱基对（14kb），若同时使用BamHⅠ和Smal两种限制酶切割，产生的片段有5kb、7．5kb、1．5kb,则只用限制酶BamHⅠ切割时产生的片段长度分别是_____和______。

研究者根据果蝇X染色体上红眼基因B设计出sgRNA，导入果蝇早期胚胎细胞，“敲除”部分胚胎细胞中的红眼基因B，得到镶嵌体果蝇（即复眼中部分小眼呈红色，部分小眼呈白色），如下表

（1）由实验结果分析，sgRNA的导入______了果蝇胚胎的存活率，若要从相同数量的早期胚胎中获得数量最多的镶嵌体果蝇，应选用的sgRNA最佳浓度为____ ng/mL。

（2）如图所示，敲除基因时，sgRNA与红眼基因B的部分序列互补配对，细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起红眼基因B发生碱基对________，导致基因突变。该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用类似于______酶的作用，敲除后需要________酶对DNA上的切口进行修复。

（3）若研究者要通过测交实验验证镶嵌体雄果蝇的基因组成，应将镶嵌体雄果蝇与表现型为___________ 的果蝇进行杂交，预期杂交后代的表现型是_______________。

（4）这种定点敲除基因的方法为艾滋病的治疗提供了一个思路。HIV通过识别膜蛋白C侵入宿主细胞，研究者可以根据_____________的核苷酸序列设计sgRNA，导入骨髓________细胞中，有效阻止HIV侵染新分化生成的T淋巴细胞。

应用生物工程技术可以获得人们需要的生物新品种或新产品。据图回答下列问题。

(1)在培育转人生长激素基因牛的过程中,①过程需要的酶是 ,

②过程常用的方法是     。 

(2)可通过转人生长激素基因牛分泌的乳汁来生产人生长激素,在基因表达载体中,人生长激素基因的首端必须含有                 。

(3)prG能激发细胞不断分裂,通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体时,Ⅱ最可能是   细胞,Ⅲ代表的细胞具有                 的特点。 

(4)在抗虫棉培育过程中,④过程中的受体细胞如果采用愈伤组织细胞,则与采用叶肉细胞相比较,其优点是          ,⑤过程采用的技术是      。 

(5)要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后是否能稳定遗传并表达,需进行检测和鉴定工作,请写出在个体水平上的鉴定过程:                                            。 

正常细胞中含有抑癌的P53基因，能表达抗病毒蛋白，帮助修复轻度变异的基因，也能使重复变异的细胞发生凋亡而避免肿瘤的发生；若它失活而不能表达，则基因突变的细胞易形成肿瘤。基因治疗肿瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖细胞和对人体基本无害而成为良好的基因载体。野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1，因此需要重新构建有疗效的、安全的腺病毒。图甲、乙中箭头所指为相应限制酶切点。

（1）人体DNA的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由___________________________________连接。

（2）DNA解旋酶直接作用于脱氧核苷酸之间的           键（化学键）；DNA限制酶直接作用于脱氧核苷酸之间的           键（化学键）。

（3）构建重组腺病毒时，限制酶最好选择           ，理由是：既可以去除    _基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏          基因以防止其           。

（4）将目的基因与腺病毒重组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野生型病毒的DNA，这是因为                                    。

（5）某DNA分子片段含有1000个碱基对。经扩增后，分别只用限制酶EcoRⅠ与同时用EcoRⅠ和HalⅢ两种方法切割，其电泳结果如图丙所示，可推断限制酶HalⅢ在该DNA片段上的切点有      个。

请回答以下有关基因工程的问题：

(1)基因工程中切割DNA的工具酶是________。DNA连接酶根据其来源不同，分为____________________________________。

(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。

(3)________________是基因工程的核心步骤。启动子是____________识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA。

(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是________________。

(5)要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用的方法是________________技术。