回答下列（一）、（二）小题。

(一）某研究小组欲用苹果汁为原料，利用发酵瓶制作果酒和果醋，请分析回答：

(1)将苹果汁放入发酵瓶，要预留约________的空间。为得到酒精和糖含量较高的果酒，可在果汁中加入一定比例的______。若发酵瓶内持续无气泡产生，则需加入更多的_______，使发酵作用尽快发生。

(2)变酸的果酒表面有一层醋杆菌形成的菌膜，若要在该菌膜中筛选高表达量的醋杆菌菌株，可通过获得_______的方法来分离筛选。若要统计获得菌种的数目，则常采用_________法。对获得的优质醋杆菌菌种常用划线法接种在固体培养基______上低温保存。

(3)下图是果酒和果醋的发酵装置，关于果醋发酵叙述错误的是_______

A.发酵前，瓶内酒—冰混合物的pH需调至7.0

B.发酵过程中，充气口要适时适量充气

C.发酵过程中，排气口排出醋酸发酵产生的CO₂

D.发酵完成后，出料口的pH值不再减少

 (二）请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。

(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时，利用一定的物质，如生物诱  导剂_____作介导，使经免疫的小鼠脾细胞与________细胞融合，筛选出融合的细胞再进行细胞的______培养，获得纯系细胞，同时还要进行________检验，以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。

(2)有关杂交瘤细胞体外培养的叙述，正确的是________

A.用固体培养基培养          B.用滋养层细胞支持生长

C.能进行传代培养            D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物

(3)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体，科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导人到受体细胞，该技术的核心步骤是______________,噬菌体是这些关键基因的___________。

番茄的抗病（R）对感病（r）为显性，高秆（D）对矮秆（d）为显性，控制上述两对相对性状的基因分别位于两对同源染色体上。为获得纯合高秆抗病番茄植株，研究人员采用了如图所示的方法。

（1）若过程①的F₁自交两代，产生的后代中纯合抗病植株占__________。

（2）过程②若只考虑F₁中分别位于n对同源染色体上的n对等位基因，则利用其花药离体培育成的单倍体幼苗的基因型，在理论上应有__________种；若单倍体幼苗通过加倍后获得M株番茄，通过筛选得到的高秆抗病植株的基因型为__________，约有__________株。

（3）过程③由导入抗病基因的叶肉细胞培养成转基因植株需要利用________________技术

（4）过程④“航天育种”方法的原理是____________。卫星搭载的种子应当选用萌发的而非休眠的种子，原因是______________________________ 。

[生物——选修3：现代生物科技专题]

基因工程技术包括一系列的分子生物学操作步骤。请回答下列问题：

（1）基因工程操作的核心步骤是                              。

（2）cDNA文库的构建方法为                   。

（3）限制酶、DNA连接酶和              是基因工程的基本操作工具。其中限制酶的特点是                                    。

（4）Mullis教授因发明PCR技术获1993年诺贝尔奖，PCR技术中需要的酶是          ，若PCR进行30轮循环，理论上可获得    个基因片段。

（5）将目的基因导入动物受体细胞的方法是                    。

（6）周光宇教授提出的花粉管通道法为我国的转基因抗虫棉作出重要贡献。请写出分子水平检测抗虫棉基因是否表达的方法        及个体水平鉴定的方法            。

【生物——选修3：现代生物科技专题】

菊天牛是菊花的主要害虫之一，为达到防治目的，科研人员通过转基因技术培育出了抗虫菊花。请回答下列问题：

（1）可用处理土壤农杆菌，使其处于以便吸收重组质粒。

（2）将重组质粒导入土壤农杆菌的目的是利用农杆菌能够的特点，使目的基因进入受体细胞中，并插入到菊花细胞的上，最终形成转基因植株。

（3）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的的基因时，需根据的脱氧核苷酸序列设计特异引物，以为模板进行第一轮扩增。

（4）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如下表所示：

①对照组应饲喂等量的菊花嫩茎及叶片与人工饲料混合物。

②据表分析，实验组与对照组差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答：

（注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）

（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是_        __，此外还可用                 作为载体。

（2）下图限制酶M和N切割产生的黏性末端是__ ____ ____ __，连接它们所需要的基本工具是__              ________。

（3）为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用__  _____处理，使其处于感受态。

（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及___________和  ________ 的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。

（5）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据抗虫基因（目的基因）两端的部分碱基序列设计特异引物，若其中一种引物共用了31个，则目的基因最多扩增了__  __次。

（6）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如下表所示。

请据表回答：

①对照组应饲喂等量的__                ________                __。

②据表分析，__               ____            __差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：

（1）为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的_______________（复制原点、启动子、标记基因）。

（2）水稻的转化过程为：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过________过程，培养出________________________，然后用______________________法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，最后诱导形成水稻植株。

（3）为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有mRNA并反转录成______________________，再以反转录产物为模板，进行基因扩增。若以根细胞为材料扩增结果为阳性（有产物生成），以叶细胞为材料扩增结果为阴性（无产物生成），则说明_______________________________________________________________

（4）将生长至4叶期的转基因幼苗转入____________________溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察现象，若___________________则说明转基因植株获得了耐盐特性。

请回答下列有关转基因抗病毒马铃薯的问题：

  （1）获取抗病毒基因常用的方法有______________________、_____________________________________、__________________________________。

  （2）获得转基因马铃薯的核心操作是_______________________________________，其中与调节抗病毒基因转录有关的部分是_______。

  （3）利用农杆菌转化法将抗病毒基因导入马铃薯，首先应将重组质粒导入_________，再将它与切成小圆片的马铃薯叶片共同培养，使插入在Ti质粒上的______________中的抗病毒基因可以转移至受体细胞，并整合到马铃薯的_________________________。

  （4）将共同培养后的马铃薯转移到特定的培养基上，在___________________________（填激素名称）的协同调控作用下，经过脱分化形成_________________，再分化得到胚状体或丛芽；对获得的植株进行个体生物学水平鉴定的做法是__________________________。 

基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作物的性状。通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分。多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR技术。请回答：

（1）我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得     、     、延熟的转基因作物。

 （2）引物是根据           的一段核苷酸序列合成的，每种基因扩增需要一对引物的原因是                                       。下表是A、B、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要在                            。

（3）PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是                          。

（4）检测人员通过多重PCR技术确定农作物中是否含有A、B、C三种转基因。将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图。

 据图分析：含有三种转基因的农作物是____    ，判断依据是                                            。

 （5）与PCR技术相比，多重PCR技术的优势                             。  

利用基因工程技术培育转基因抗冻番茄.该过程需要用多种限制酶,下图依次表示EcoR I、Sma I、Nae I三种限制酶的识别序列及切割位点.

请回答:

（1）上述限制酶在特定位点切割DNA,其实质是断开DNA分子每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_______切割后产生了____________末端.

（2）利用EcoR I和NAE酶切得某种鱼的抗冻蛋白基因,可与被EcoR I和Sam I酶切后的质料连接成重组质料,原因是___________

（3）重组质料导入番茄后,欲检测抗冻蛋白基因是否转录出mRNA,需利用__________作探针.

（4）利用抗冻蛋白制备出相应的__________,然后进行抗原-抗体杂交,观察到杂交带出现,尚不足以确定转基因抗冻番茄培育是否成功.因此,还应将转基因番茄__________,以确定其耐寒能力是否提高

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图一、图二中箭头表示相关限制酶的酶切位点。

A．DNA自我复制           B．DNA以其一条链为模板合成RNA

C．RNA自我复制           D．按照RNA上密码子的排列顺序合成蛋白质

（2）限制酶Sma和限制酶Xma作用的不同点是_________________________________。

（3）图二中的目的基因D需要同时使用Mse酶和Pst酶才能获取，而图一所示的质粒无相应的限制酶切位点。所以在用该质粒和目的基因构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。试写出构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件）：

①首先用_______________酶处理质粒；

②然后用_______________酶处理质粒，使被切开的质粒末端连接上相应的脱氧核苷酸；

③再运用T₄DNA连接酶处理质粒，形成新的限制酶切位点，即可被_________酶识别。

（4）基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。下图表示运用影印培养法（使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有________________________。从检测筛选的结果分析，含目的基因的是________（填编号）菌落中的细菌。