下图表示某科学家利用胚胎干细胞对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的相关过程，据图回答下列问题：

（1）步骤①②利用的技术名称分别是                 、                     。图中造血干细胞中的遗传物质至少有         个来源。

（2）若利用PCR技术扩增目的基因并完成图示小鼠的基因治疗，涉及的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和                  等。

（3）下图所示的一个质粒分子经EcoRⅠ切割前后，分别含有      、          个游离的磷酸基团。由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，故利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取       作为引物。一个目的基因通过PCR技术扩增第n次时，需要        个引物。

（4）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发       色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否转录，可以采用                        的技术。

下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是

定点突变技术是指通过聚合酶链式反应（PCR）向目的基因片段中引入所需变化。GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第65至67位的三个氨基酸（丝氨酸﹣酪氨酸﹣甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第66位酪氨酸换成组氨酸，即可发出更明亮的蓝光，成为蓝色荧光蛋白。

⑴定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，据图中信息人工合成短DNA 引物应包含的序列是___________，突变位点一般设计在引物中间位置的理由是___________，该定点突变技术是否成功的标志是___________，该技术属于___________工程的范畴。

⑵如下图所示，如果要用PCR 扩增以下DNA 模板中的基因1（左），一位同学设计了一对引物如下（右），该设计不合理的理由是___________。

5′－－－－－－基因1－－－－－－3′ 引物1 5′－－AGATCT －－－3′

3′－－－－－－基因1－－－－－－5′ 引物2 5′－－TCTAGA －－－3′

⑶下图表示引物修正后PCR 扩增目的基因（基因1）的第___________轮循环的示意图。若再进行一轮循环，仅有基因1（含引物）的DNA 片段有___________个。

融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如下图1所示。下图2是中间载体1和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于载体外侧），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题。

（1）图1第一阶段中PCR至少进行____________次循环，才能获得双链等长的含引物2的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
（2）若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计__________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__________种。
（3）图2中需使用__________（填限制酶）和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。

（4）叶绿体定点整合表达载体中_____________________________________________（填基因）能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是____________________________________。

含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题

（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是从                生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是                （填“基因组文库”,“cDNA文库”或“基因组文库”和“cDNA文库”）

（2）含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有①                ；②                。

（3）利用PCR扩增目的的基因的过程由高温变性（90~95°C）,低温复性（55~60°C），适温延伸（70~75°C）三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在                °C处理后仍然具备催化活性。

（4）在PCR扩增目的基因时，为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记，反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的                （填“腺嘌呤核糖核苷酸”，“dATP”或“ATP”）.

自然条件下，哺乳动物不发生孤雌生殖。2014年3月，云南农大科研团队把猪卵母细胞进行人为的孤雌激活处理，使其发育成胚胎，移植到代孕母猪体内，获得世界上第一批成活的孤雌生殖克隆猪。这种克隆猪不同于核移植获得的克隆猪。现将两种技术进行比较。

（1）图中过程_____________(填序号)是获得核移植克隆猪的技术流程。   

（2）孤雌激活处理其实质是要激活卵母细胞的_______________，使其发育成早期胚胎，得到克隆猪。

（3）体细胞核移植技术中也会用到卵母细胞，需要选择_________时期的卵母细胞，并用微型吸管吸出_________。欲得到更多的卵母细胞，需用__________处理良种母猪。

（4）早期胚胎移植时，必需移植到同种____________的其他雌性动物子宫中，才可能移植成功。

（5）可以从良种不同的克隆猪中提取mRNA直接进行研究，也可通过_______方法得到多种cDNA，并通过_____技术扩增产物

图1

(1) 过程②中常用____技术将目的基因导入受精卵,受精过程中精子头部接触卵细胞膜时产生____反应,以防止多精入卵。 

(2) 过程⑤在精核与卵核融合之前,用微型吸管吸除雄核,再用细胞松弛素B处理(作用类似于用秋水仙素处理植物细胞),处理后的受精卵可发育成猕猴。这种方法在动物新品种选育中的显著优点是_________________。 

(3) ⑦过程通过____技术实现,在个体水平上检测GFP基因是否表达的方法是______________。 

(4) 胚胎工程中通常需要鉴定胚胎性别,如利用SRY—PCR技术鉴定,鉴定时需以Y染色体上的SRY基因(性别决定基因)的一段序列设计引物,用被测胚胎DNA作模板进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20~24个核苷酸,其不宜过短的原因主要是_。 

图2