定点突变技术是指通过聚合酶链式反应（PCR）向目的基因片段中引入所需变化。GFP（绿色荧光蛋白）的发光基团是第65至67位的三个氨基酸（丝氨酸﹣酪氨酸﹣甘氨酸），该发光基团可利用定点突变技术使第66位酪氨酸换成组氨酸，即可发出更明亮的蓝光，成为蓝色荧光蛋白。

⑴定点突变第一步得把突变位点设计在引物上，据图中信息人工合成短DNA 引物应包含的序列是___________，突变位点一般设计在引物中间位置的理由是___________，该定点突变技术是否成功的标志是___________，该技术属于___________工程的范畴。

⑵如下图所示，如果要用PCR 扩增以下DNA 模板中的基因1（左），一位同学设计了一对引物如下（右），该设计不合理的理由是___________。

5′－－－－－－基因1－－－－－－3′ 引物1 5′－－AGATCT －－－3′

3′－－－－－－基因1－－－－－－5′ 引物2 5′－－TCTAGA －－－3′

⑶下图表示引物修正后PCR 扩增目的基因（基因1）的第___________轮循环的示意图。若再进行一轮循环，仅有基因1（含引物）的DNA 片段有___________个。

2015年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获奖。工业上青蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路。科学家先通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现该高产植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是______________________。

（2）如果用青蒿某个时期mRNA反转录产生的双链cDNA片段，用该双链cDNA进行PCR扩增，进行了30个循环后，理论上可以产生约为__________个DNA分子，该双链与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做青蒿的________，获得的cDNA与青蒿细胞中该基因碱基序列___________（填“相同”或“不同”）。

（3）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建_______________,构建好的重组质粒在其目的基因前端要加上特殊的启动子，启动子是___________识别结合的位点。

（4）检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取_______________技术。目的基因导入组织细胞后，通过________技术培育出青蒿幼苗。

【生物一选修3现代生物科技专题】
    请结合所学知识及相关信息回答下列问题：
（1）基因工程常用限制性核酸内切酶切割DNA分子，切割后产生的DNA片段的末端类型有             和平末端。
（2）面对转基因技术的利弊，我们应持有的正确做法                           。
下列关于现代生物工程技术的安全性和伦理问题的分析，不合理的观点是：            。
A．转基因生物合成的某些新的蛋白质有可能成为某些人的过敏原或者引起中毒
B．运用DNA重组技术可以将致病菌或病毒改造成威力巨大的生物武器
C．我国的政策是禁止进行生殖性克隆人
D．转基因生物进入自然界后不会与野生物种杂交而威胁其他生物的生存
（3)设计试管婴儿技术与为解决不孕夫妇的生育问题而出现的试管婴儿技术主要区别是植入前对胚胎进行                   。
（4）PCR技术是一种DNA的扩增技术。该过程除需目的基因和原料（包括 dATP、 dGTP、           、         ）之外还需提供   种引物和热稳定DNA聚合酶。进行PCR时需加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，此操作的目的                                 。
（5）DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同。在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解，部分蛋白质盐析生成沉淀；在           mol/LNaCl溶液中时，DNA析出。在沸水浴的条件下，DNA溶液遇             试剂会被变成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA。

为了使番茄的耐寒能力大大提高，科学家将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄。回答下列相关问题：

（1）在该过程中，研究人员首先获取目的基因，并采用PCR技术対目的基因进行扩增，该技术需要的条件是：          、模板、原料和引物。引物必须能和模板DNA的______（填“3’末端”或“5’末端”）结合。

（2）若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________(答出两点即可).为了确保在番茄中获得抗冻蛋白，必须在抗冻蛋白基因的首端添加特定的          。基因工程核心步骤是                     。

（3）研究人员通常采用          法将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄细胞内，通常采用          技术，在分子水平检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质。若培养的转基因番茄抗冻能力没有明显的提高，则理论上应该调整基因结构的______部分的碱基序列。

在基因工程中，为了获得目的基因，一般有三种方法：

(1)通过        获得目的基因。这一方法是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，分别导入受体菌中，储存起来而获得的。

(2)           技术。这一方法模仿了DNA复制原理，根据已知目的基因的脱氧核苷酸序列，合成一对含大约20个碱基的引物，引物本身确定了从DNA的哪个位置开始复制，这样，就可以利用含目的基因的DNA长链，复制出大量的目的基因（短链）出来。在复制时，需要周期性地调节反应系统的温度，在大约90-95⁰C时，DNA双链       (互补结合或解旋分离)，这一步        (需要或不需要)解旋酶；降温后，引物与单链DNA的特定序列结合，以         为原料，合成子链，从5^，端到3^，端延伸，延伸的过程中，需要            (填某物质)，此物质能耐95⁰C的高温而不被破坏。

(3)             方法。此方法一般用于基因较小，且核苷酸序列已知的情况下。