图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是_______________

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是_______________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。

下图表示“华恢l号”抗虫水稻主要培育流程，据图回答：

（1）杀虫基因（crylA）是根据几种Bt毒蛋白的分子结构，设计并人工合成的，这属于______________工程技术范畴。

（2）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制酶作用位点），据图分析：

①人工改造质粒时，要使抗虫基因能成功表达，还应插入________________。

②人工改造质粒时，用限制酶Ⅰ处理，其目的是：第一，去除质粒上的____________（基因），保证T－DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；第二，使每种限制酶在质粒上只有单一作用位点，有利于__________。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。

③若用限制酶Ⅱ分别切割经过②过程改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是：在含四环素的培养基中____________，含卡那霉素的培养基中______________。

（3）“华恢l号”抗虫水稻主要培育流程④过程中，需使用的生物技术是__________。要确定杀虫基因（crylA）导入受体细胞后，是否能表达，需进行检测和鉴定，请写出在个体水平上的鉴定过程：________________________________。

以下为人工合成 reAnti 基因，转入猪成纤维细胞，做成转基因克隆猪的培育过程示意图，请据图回答：

（1）基因工程的核心是 ________  (用序号回答）

（2）基因工程基本工具之一的限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，大多数限制酶的识别序列是由________个核苷酸组成。                                  

（3）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、噬菌体衍生物等。

（4）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为 ________。                                                                                                                                  

（5）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞后，要通过 DNA 分子杂交技术，  来检测reAnti基因是否已重组到猪胎儿成纤维细胞的________上。

（6）从猪中取胎儿成纤维细胞，用胰蛋白酶处理，然后进行分散培养。多数细胞生存的适宜 PH 范围是________。

（7）去核前的卵母细胞应培养到________期。其去核后与成纤维细胞通过电刺激后融合，形成重组细胞，再利用物理或化学方法刺激，使之完

成细胞________，在体外培养成重组早期胚胎。

（8）在进行过程⑦操作前，应用激素对受体母猪进行__________处理。

请回答：

（1）培育转基因奶牛时，需要在生长激素编码序列前插入      的启动子。

（2）由基因表达产物无法推知启动子碱基序列，其原因是      。

（3）过程①需选择的限制酶是      ，过程③需选择的限制酶是      。过程④需要使用的工具酶是      。

（4）过程④中可以根据编码序列两端的部分碱基序列设计      进行扩增。扩增过程中，在第      轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

（5）过程⑤中克隆的启动子与外源基因编码序列连接时，原引物a所在的P片段的碱基对数目应是3的整数倍，目的是      （2分）。

如表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．

（1）限制酶SmaⅠ和XmaⅠ作用的不同点是_______________________．

（2）图2中的目的基因D需要使用_______________剪切才能获得，因而需要对图1所示的运载体进行改造，构建新的限制酶酶切位点，试帮助完成构建过程（填括号中物质的序号）：首先用__________处理质粒；然后用__________处理质粒，使被切开的质粒末端连接上相应的脱氧核苷酸；再用

__________处理质粒，形成相应的限制酶酶切割位点，它可被_______识别．（构建需要的所有条件如下：①EcoRⅠ②MseⅠ③PstⅠ④DNA连接酶⑤DNA聚合酶）

（3）检测筛选是一个重要步骤，图3表示在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种方法与培养方法，以检测基因表达载体是否导入大肠杆菌，培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有______和_______．从筛选结果分析，含目的基因的是_______（填图中编号）菌落中的细菌．

番茄红素具有一定的抗癌效果，但在番茄红素环化酶的催化作用下，易转化为胡萝卜素。科学家利用基因工程设计了重组DNA（质粒三），并导入番茄细胞，从而阻止番茄红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。请回答下列问题：

（2）先构建“质粒二”的原因主要是利用质粒二中含有                       。利用限制酶BamHⅠ开环后去磷酸化的目的是                                   ，再用Ecl酶切的目的是                                                   。

（3）质粒三导入受体细胞并表达后，形成双链RNA（发卡）的原因是                                                                。“发卡”在受体细胞内可以阻止                                            过程，从而使基因“沉默”。

（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是 ______ ．

（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入 ______ ．

在20世纪初，科学家用植物细胞杂交方法，将白菜的原生质体和甘蓝的原生质体融合，成功地培育出了“白菜—甘蓝”杂种植株，据图回答下列问题：

（1）过程b完成的标志是      。要促进杂种细胞的分裂生长，培养基中应有营养物质和激素，其中激素包括        和           两类植物激素。

（2）在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，依据的原理是          ，c涉及的分裂方式为                  。

（3）若白菜细胞内有m条染色体，甘蓝细胞含n条染色体，则“白菜—甘蓝”细胞内含     条染色体；若杂种细胞培育成为“白菜—甘蓝”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于几倍体植株？       。

（4）利用基因工程菌生产药物目前已经成为了一项成熟技术，如图所示为将人类的白细胞介素2基因（白细胞介素2是一种具有免疫活性的可溶性蛋白质）导入到大肠杆菌体内，获得能够生产白细胞介素2的“工程菌”的示意图，结合所学知识回答下列问题：

为了培育含有人类的白细胞介素2基因工程菌，需要大量的目的基因，这可利用________技术在体外进行，该项技术是利用DNA复制的原理，使基因数量呈指数方式增加。

（5）在构建基因表达载体过程中，需要利用到的基因工程工具有________，图中构建好的基因表达载体中作为标记基因的是________。

（6）基因工程制药中经常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的原因是________。以细菌为转化对象时，要用Ca2＋处理细胞，使之处于感受态，这种状态下细胞的特点是________。

（7）在筛选已经成功导入目的基因的细胞时，可以利用含有________的培养基进行，最终确定目的基因成功转化，即产生白细胞介素2则可采用________技术。

应用基因工程技术可获得人们需要的生物新品种或新产品。根据资料和图解回答下列问题：

资料1：蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊。资料2：将疫苗藏身水果蔬菜中，人们在食用这些转基因植物的同时也获得免疫力，因而无需免疫接种，这一新概念将引起疫苗研究的一场革命。

（1）过程①⑤所需要的工具酶有_____________，构建的蜘蛛丝蛋白基因表达载体一般由目的基因、_______ 、启动子、________等部分组成。

⑵过程②将重组质粒导入山羊受体细胞时，采用最多也最有效的方法是___________。通过①～④过程培育的蜘蛛羊可以作为乳腺生物反应器，从__________中提取所需要的蜘蛛丝蛋白。

⑶如果将过程③获得的早期胚胎进行如图分割，则操作正确的是______________。

A.

B.

C.

D.

⑷通过⑤⑥⑦培育转基因莴苣，相比诱变育种和杂交育种方法，具有____和_____等突出优点。

科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达．但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选．已知限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制性核酸内切酶II的识别序列和切点是-↓GATC-，据图回答：

(1)过程①表示的是采取             的方法来获取目的基因。

(2)根据图示分析，在构建重组质粒过程中，应用限制性核酸内切酶        （Ⅰ或II）切割质粒，用限制性核酸内切酶          （Ⅰ或II）切割目的基因。

(3)人的基因之所以能与大肠杆菌的质粒进行重组，原因是                     。

(4)将重组质粒导入细菌B之前，要将细菌B放入一定浓度的         溶液中处理，目的是                                。

(5)要筛选出含目的基因的受体细胞应将大肠杆菌培养在含           的培养基上

(6)人体的生长激素基因能在细菌体内成功表达是因为                    ，写出目的基因导入细菌中表达的过程                        。