Ⅰ.下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点  的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对长度）。请回答下列问题：

（2）该基因来自__________________（填“基因组文库”或“cDNA文库”）。

（3）翻译时与密码子发生碱基互补配对的是__________上的反密码子。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)cDNA文库属于_____基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_____反转录产生的cDNA片段，与________连接后储存在一个受体菌群中。

(2)切割DNA分子的工具是_______________，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断开，形成黏性末端或平末端。

(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是________DNA连接酶。

(4)如果受体细胞是大肠杆菌，需要用________处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。

图1 表示含有目的基因D 的DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列,图2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamHⅠ、Mbo、Sma 4 种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为

C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题:

(1)图1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 脱氧核糖--_________--脱氧核糖 连接。

(2)若用限制酶Sma完全切割图1 中DNA 片段,产生的末端是 ______ _ 末端,其产物长度为__________________。

(3)若图1 中虚线方框内的碱基对被T-A 碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1 及其对应的DNA 片段,用限制酶Sma 完全切割,产物中共有_____种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是 ________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_________     的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D 不能正确表达,其最可能的原因是 _____________________________________________。

回答下列有关基因工程的问题。

下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Ap^r表示抗青霉素的抗性基因，Tc^r表示抗四环素的抗性基因。

A．X－1             B．X－2            C．X－3             D．X－4

（2）若将上图所示X－1、X－2、X－3、X－4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有＿＿＿＿＿＿＿＿     、＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）若将外源的Tc^r基因两端用E2切开，再与用E2切开的X－1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示：

含X－4的细胞数与含X－1的细胞数之比为1：3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？_____________；原因是__________________________。

农业科技工作者在烟草中找到了一抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育抗病棉花品系。请回答下列问题。

（1）为了能把该抗病基因转入到棉花细胞中，常用的载体是__________。

（2）要使载体与该抗病基因连接，首先应使用限制性内切酶（限制酶）进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端是（    ）

（3）切割完成后，采用DNA连接酶将载体与该抗病基因连接，连接后得到的DNA分子称为_____。

（4）再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去_________棉花细胞，利用植物细胞具有的_________性进行组织培养，从培养出的植株中筛选（选择）出抗病的棉花。

（5）转基因棉花获得的_______________是由该表达产物来体现的。

（1）用图中的目的基因与质粒构建基因表达载体时，应该选择质粒         ，选择的限制酶是          。

（2）如果选择的质粒与目的基因重组成功，并且在受体细胞中能正常表达，则所形成的重组质粒用EcoRI完全酶切，并进行电泳观察，可出现的片段长度有        或         。

（3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，可将大肠杆菌先用        处理。导入大肠杆菌后，为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，在普通琼脂培养基中还需加入        ，形成的菌落颜色为           。

（4）如果要检测导入目的基因的大肠杆菌是否合成相应的蛋白质，可以采用        法。

真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：

(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。

(2)若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是_____________________。

(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________(答出两点即可)等优点。

(4)基因工程中获取的目的基因主要是指                            基因。

(5)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是                              （写出两点即可）。

请利用所学知识回答基因工程方面的有关问题：

（1）基因工程所用的生物学原理为_________________，其操作的核心步骤为_________________，在操作的过程中没有涉及碱基互补配对的步骤为_________________，获取目的基因的来源有_________________和_________________。

（2）利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物A、B为单链DNA片段，它是目的基因子链合成延伸的基础。

PCR过程除需要适宜的温度、模板DNA、引物，还需要_____________、_____________等条件才能扩增出大量DNA片段。

（3）将目的基因导入植物细胞时，采用最多的方法是_________________。目的基因进入受体细胞后的表达过程中，RNA聚合酶需与_________________识别和结合，从而驱动转录过程。最终目的基因是否成功表达，常用_____________方法进行检测，若出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。

（4）蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，其基本流程为_________________、

________________、________________、找到对应的脱氧核苷酸序列。

下图表示某科学家利用胚胎干细胞对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的相关过程，据图回答下列问题：

（1）步骤①②利用的技术名称分别是     。图中造血干细胞中的遗传物质至少有       个来源。

（2）若利用PCR技术扩增目的基因并完成图示小鼠的基因治疗，涉及的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和       等。

（3）下图所示的一个质粒分子经 EcoRⅠ切割前后，分别含有        个游离的磷酸基团。由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，故利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取        作为引物。一个目的基因通过PCR技术扩增第 n次时，需要       个引物。

（4）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发      色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否转录，可以采用      的技术。