请回答下列有关基因工程的问题．

（1）基因工程操作的核心步骤是  _____________．若选择的限制酶切出的DNA片段是平末端，应选择___________进行连接．

（2）将目的基因导入到植物细胞采用最常用的方法是____________，该方法通常要把目的基因插入________的T﹣DNA中，这是利用T﹣DNA_______的功能．

（3）在基因工程操作中，若要在短时间内大量获取目的基因，可用_____扩增DNA，该技术的原理是____________________．

2015年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获奖。工业上青蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路。科学家先通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现该高产植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是______________________。

（2）如果用青蒿某个时期mRNA反转录产生的双链cDNA片段，用该双链cDNA进行PCR扩增，进行了30个循环后，理论上可以产生约为__________个DNA分子，该双链与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做青蒿的________，获得的cDNA与青蒿细胞中该基因碱基序列___________（填“相同”或“不同”）。

（3）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建_______________,构建好的重组质粒在其目的基因前端要加上特殊的启动子，启动子是___________识别结合的位点。

（4）检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取_______________技术。目的基因导入组织细胞后，通过________技术培育出青蒿幼苗。

下图是用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请作答。

（1）①过程如果使用人的肝细胞，则不能成功，原因是                                                                                      。

（2）过程②必需的酶是         酶，过程④必需的酶是            酶。

（3）在利用A、B获得C的过程中，必须用                   切割A和B，使它们产生             ，再加入                    ，才可形成C。

（4）为使过程⑧更易进行，可用                     （试剂）处理D。

（5）不同种生物之间的基因能拼接成功，从分子结构角度分析是因为：                  ，目的基因在不同的生物细胞中能正确表达，说明了不同生物共用                          。

请回答下列有关胚胎工程和基因工程等方面的问题：

（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞讲行核移植的原因是                               。在哺乳动物的核移植实验中,一般通过             (物理方法)将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育，当胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段时，将胚胎植入同种的、生理状态相同的另一雌性（代孕）动物体内。为获得多只与该哺乳动物遗传物质相同的个体，还可使用         技术。

（2）在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子进行获能处理。该处理有                             两种方法。另外，培养的卵母细胞需要发育至                   ，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和第一极体。

（3）在基因工程中若要使获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ蛋白，则所构建的基因表达载体必须包括:某种牛乳腺分泌蛋白基因的启动子、               、终止子、标记基因和复制原点等。目前常用的措施是将该基因表达载体导入牛的      (填“受精卵”或“乳腺细胞”）。若要检测牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白，可采用               技术。

为实现目的基因与运载体结合，以便在大肠杆菌中大量表达相应的蛋白质，研究人员进行了如图所示操作。请分析回答下列问题：

（1）图表示用BamH I切割含目的基因的DNA片段，质粒经相同限制酶处理后，经________酶的作用获得a，a称作_________。将a与感受态大肠杆菌混合后，混合物应接种在含有________的培养基上。质粒中抗氨苄青霉素基因称为______，在筛选过程起作用。若要证明培养基是否符合实验要求，培养基上需接种________的感受态大肠杆菌，培养后不出现菌落则培养基合格。

（2）DNA分子中，一条链中的两个核苷酸通过_________相连；如果要检测目的基因是否成功表达，须提取培养后大肠杆菌的__________，用相应抗体检测。

（生物—选修3 现代生物科技专题）

在药品生产中，人们逐步利用基因工程技术生产出如干扰素，白细胞介素，凝血因子等各种高质量低成本的药品，请分析回答：

(1)在用目的基因与质粒形成重组DNA过程中，一般要用到的工具酶是限制酶和DNA连接酶，其中限制酶切割的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿键,其特点是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

(2)将含有“某激素基因”的质粒导入细菌细胞后，能在细菌细胞内直接合成“某激素”，则该激素在细菌体内的合成包括＿＿＿＿＿＿＿＿和                   两个阶段。

(3)基因工程形成工程菌的遗传学原理是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

(4)基因工程操作的第四步是目的基因的检测与鉴定，其中分子水平的检测又分三步：首先要检测转基因生物的DNA是否插入了目的基因，采用技术是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿；其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，检测的原理是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿；最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。

资料1　巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5ˈAOX1和3ˈAOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。

资料2　巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，可以将目的基因整合于染色体中以实现表达。

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上              、                   限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。

（2）酶切获取HBsAg基因后，需用                将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取                  。

（3）步骤3中应选用限制酶               来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。

（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用              方法进行检测。

（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入              以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。

（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行               并分泌到细胞外，便于提取。

β-葡萄糖甘酸酶（GUS）基因来自大肠杆菌。转GUS基因的植物组织浸泡在含有某底物的缓冲液中，GUS能与底物发生反应，使植物组织呈现蓝色。研究人员利用转GUS基因的葡萄植株，以探究干旱调节对葡萄P启动子的功能是否有诱导作用。请回答：

（1）葡萄P启动子是____________识别并结合的位点。欲获得葡萄P启动子，可根据P启动子的核苷酸序列设计引物，利用该引物和从葡萄细胞获取的_________________为模板进行PCR扩增。

（2）将葡萄P启动子与GUS基因等元件构建基因表达载体，利用___________(方法)将该基因表达载体导入葡萄愈伤组织，葡萄愈伤组织在培养基中经______________后，进而发育形成转基因葡萄植株。

（3）取上述转基因葡萄植株分为A、B两组，A组置于正常条件（无干旱处理）下培养，B组置于干旱条件下培养。一段时间后分别取A、B组葡萄植株幼根，浸泡在含有底物的缓冲液中，观察幼根颜色变化情况。

①若A、B组的结果分别为____________________，则葡萄P启动子的功能受干旱诱导。

②若A、B组的结果分别为____________________，则葡萄P启动子的功能不受干旱诱导。