鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是______。科研人员还在两种引物的一端分别加上了_________和__________序列，以便于后续的剪切和连接,一个DNA分子三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有________个． 为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是________。

A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________，步骤③中需先用_____处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过_______获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________。

T₄溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T₄溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T₄溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。请回答问题：

（1）上述操作涉及的技术属于________工程，该技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→________→________→找到相应的脱氧核苷酸序列。

（2）在确定目的基因的碱基序列后，可通过________的方法获取目的基因，再利用________技术进行扩增。用这种方法获得的目的基因与从生物体内直接提取的目的基因在结构上的区别是________。

（3）在将目的基因导入受体细胞前，要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有________、________以及标记基因等。

近年来，有关肿瘤细胞特定分子的靶向治疗研究进展迅速。研究发现，蛋白是细胞膜上的一种受体，由原癌基因表达，原癌基因过量表达会持续激活细胞内的信号传导，启动细胞DNA的复制，导致细胞异常增殖，利用动物细胞融合技术制备的单克隆抗体，可用于诊断和治疗原癌基因过量表达的肿瘤，请回答下列问题：

（1）通过检测原癌基因的_________和_________可判断其是否转录和翻译。检测成人多种正常组织后，发现原癌基因只在乳腺、呼吸道等上皮细胞中有微弱表达，这说明___________________________________________。

（2）根据以上信息，可推测原癌基因的主要功能是________________________。

（3）制备该单克隆抗体时，免疫动物的抗原可以是______。B淋巴细胞识别抗原并与之结合，之后在适当的信号作用下增殖分化为______和_____。

（4）用该单克隆抗体处理原癌基因X过量表达的某肿瘤细胞株，发现其增殖能力明显下降，这是因为_____________________________。

2016年9月15日天宫二号在酒泉卫星发射中心发射成功，高等植物拟南芥就幸运地当选为“植物航天员”。多年来围绕拟南芥的相关研究很多，尤其是对于拟南芥转基因研究非常热门，当前拟南芥转基因所使用的方法主要是农杆菌介导的转化，在拟南芥搭载升空前植物学家预先用转基因技术给拟南芥体细胞用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记。

（1）该绿色荧光蛋白（GFP）基因取自某种生物的cDNA文库。若想短时间内得到大量的绿色荧光蛋白（GFP）基因，所用技术的中文名称是_____________，其条件除了原料、能量、模板外还需要加入_________、____________。

（2）农杆菌转化法中Ti质粒的T-DNA（可转移的DNA）可整合到植物细胞中___________上，所以构建基因表达载体时，需将目的基因插入到T-DNA序列中，该过程用到的工具酶有________________。

（3）通常采用____________技术检测绿色荧光蛋白（GFP）基因是否插入到拟南芥基因组中。若将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的拟南芥细胞培育出完整植株，需要运用的主要生物技术是____________，该技术的理论基础是___________________。

下图表示某科学家利用胚胎干细胞对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的相关过程，据图回答下列问题：

（1）步骤①②利用的技术名称分别是                 、                     。图中造血干细胞中的遗传物质至少有         个来源。

（2）若利用PCR技术扩增目的基因并完成图示小鼠的基因治疗，涉及的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和                  等。

（3）下图所示的一个质粒分子经EcoRⅠ切割前后，分别含有      、          个游离的磷酸基团。由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，故利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取       作为引物。一个目的基因通过PCR技术扩增第n次时，需要        个引物。

（4）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发       色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否转录，可以采用                        的技术。

（1）打靶载体中含有的目的基因是     ，需将该目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到质粒上，整合时用到的酶有      。

（2）图中的同源重组位点是指打靶载体和小鼠基因组DNA中具有     的DNA片段。

（3）将打靶载体线性化是选择的限制性核酸内切酶的识别序列不能位于    等中。线性化的打靶载体可采用    法导入小鼠细胞。将小鼠细胞培养在含     的培养液中，可以成功筛选出打靶成功的小鼠细胞，经细胞培养后可以获得大量的具有目的基因的细胞。

（4）可以通过动物细胞克隆技术获得含人胰岛素基因的小鼠，其过程是将打靶成功的小鼠细胞的细胞核移植到     中，培养到     期移植到代孕母鼠子宫内进行发育。

器官移植在当今的疾病治疗中普遍被应用，但在全世界的临床医学上普遍存在供体器官不足和器官移植后发生免疫排斥反应问题。为了解决上述问题，人们提出了很多设想。请根据所学知识回答下列问题：

（1）器官移植发生的免疫排斥反应属于__________（填“体液免疫”或“细胞免疫”）。__________的应用大大提高了器官移植的成功率，给需要进行器官移植的患者带来了福音。

（2）现代医学证明，可从新生儿剂带血中分离出细胞，若将来需进行器官移植，可通过培养该类细胞并加入__________因子以培育出人造组织器官，用于自身移植，这样可避免免疫排斥反应。

（3）借助核移植技术获得器官：哺乳动物核移植可以分为____________核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。对于需要进行器官移植的成年患者，可取出病人正常的体细胞，进行细胞培养，将其注入处于____________期的去核卵母细胞中，通过电刺激方法使两细胞融合，然后用物理或化学方法激活受体细胞，使____________发育成器官，由于核基因来自于病人自身，所以器官移植后也不会发生免疫排斥反应。

（4）为了扩大器官供体的来源，科学家试图利用基因工程手段抑制或祛除抗原决定基因，再利用克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的猪器官，从而解决供体短缺问题。获得该转基因猪的核心步骤是__________，在该过程中，能驱动基因转录出mRNA的是_______________。

（1）  提取目的基因①若已获取PG的mRNA，可通过_____________获取PG基因。

②在该基因上游加结构A可确保基因的反向转录，结构A上应具有   ____      结合位点。

③重组质粒转移到大肠杆菌中的目的是_____________________________。

(2)用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有___________的培养基进行筛选，培养24~48h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞________现象来鉴别细胞壁是否再生。

(3)由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与________________互补结合，因此可抑制PG基因的正常表达。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长，则可确定转基因番茄培育成功。

(4)获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，科研人员常采用           方法使子代保持转基因番茄的优良性状。

如图是用农作物①和②两个品种分别培育成④⑤⑥⑦四个品种的过程，其中A、a、B、b、D为基因，且A、a和B、b位于非同源染色体上．请回答下列有关问题：

（1）利用Ⅵ过程培育新品种⑦的一般常用的处理方法是                 。

（2）利用Ⅰ→Ⅱ途径培育品种④的原理是                ，该原理发生的时期是                  。

（3）能够明显缩短育种年限的育种过程是      (用图中罗马数字回答)，其缩短 育种年限的原因是                 ，该过程得到AAbb的概率是    。

（4）Ⅲ过程利用了         技术，该技术的优点是               。