美国新希望生殖医学中心张进团队于2016年10月19日在美国生殖医学学会会议上正式宣布，世界首个细胞核移植“三父母”男婴已于2016年4月诞生。如图是该男婴的培育过程示意图，请据图回答下列问题：

(1)上述“三亲婴儿”的核DNA由_________提供，质DNA由_________提供。由此可见，“三亲婴儿”的意义在于可以避免子代_________遗传病的发生。

(2)过程③在体外进行时需要对精子进行________处理，卵母细胞应处于_________期。

(3)过程④是早期胚胎培养，需将受精卵移入_________继续培养。体外培养需要满足的条件有：_________、营养、适宜的温度和pH，并置于_________混合气体的培养箱中进行培养。

(4)过程⑤是_________技术，取_________的滋养层细胞可以对移植前的胚胎进行性别鉴定，采用SRY-PCR的鉴定方法，在该PCR扩增过程中若消耗引物分子14个，则DNA扩增了_________次。

（1）进行DNA亲子鉴定时，首先需要用__________________将待测的样品DNA切成片段，然后用电泳的方法将这些片段分开，最后形成DNA指纹帮助确认身份。

（2）PCR技术的原理是______________，甲过程所需要的条件是______________，完成乙、丙过程需要反应体系提供___________、___________、___________等物质。

（3）利用PCR技术扩增目的基因，要有一段____________________，以便合成a、b。下图为第一轮循环产生的产物。若继续循环，该DNA片段共经过________次循环后刚好能形成所需目的基因。

融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如下图1所示。下图2是中间载体1和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于载体外侧），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题。

（1）图1第一阶段中PCR至少进行____________次循环，才能获得双链等长的含引物2的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
（2）若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计__________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__________种。
（3）图2中需使用__________（填限制酶）和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。

（4）叶绿体定点整合表达载体中_____________________________________________（填基因）能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是____________________________________。

下图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X—gal变为蓝色，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：

⑴若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有________和________。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有_______、终止子和标记基因等。对获取的目的基因可用________技术对其扩增。

⑵实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了________；若大肠杆菌菌落显白色，说明导入了________。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌________（填“能”或“不能”）在该培养基上生存。

⑶将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，若仅考虑质粒与目的基因相连接，会有   种连接方式。然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为________kb（已知目的基因的长度大于2kb，1kb＝1000个碱基对）。

金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。

（2）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（3）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。

（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。

请回答基因工程方面的有关问题。

(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。

②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。

(4)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1 000个碱基对)，请画出质粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。

下图表示某科学家利用胚胎干细胞对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗的相关过程，据图回答下列问题：

（1）步骤①②利用的技术名称分别是                 、                     。图中造血干细胞中的遗传物质至少有         个来源。

（2）若利用PCR技术扩增目的基因并完成图示小鼠的基因治疗，涉及的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、                  和胰蛋白酶等。

（3）下图所示的一个质粒分子经EcoRⅠ切割前后，分别含有      、          个游离的磷酸基团。由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，故利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取       作为引物。一个目的基因通过PCR技术扩增第n次时，需要        个引物。

（4）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发       色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否转录，可以采用                        的技术。

（2）玉米胚芽油不易挥发，宜选用_______法或________法从玉米胚芽中提取。

（3）玉米淀粉经酶解形成的葡萄糖可在葡萄糖异构酶的作用下转化成果糖。利用________技术可使葡萄糖异构酶重复利用，从而降低生产成本。

（4）利用PCR技术扩增葡萄糖异构酶基因时，需用耐高温的_______催化。PCR一般要经历三十次以上的循环，每次循环包括变性、_______和_______三步。

基因表达载体的构建是基因工程的核心。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题

（1）若用图1所示的限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，就其特异性而言，切开的是                               之间相连的化学键。

（2）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是 。

A．若图中右侧碱基序列为ACT能决定一个氨基酸，则ACT可称为一个密码子

B．DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于①②处

C．若只用这个片段中的3个碱基对，排列出的DNA片段有64种

D．就游离的磷酸基而言，该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基

（3）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取   作为引物（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）。该DNA分子在PCR仪中经过第_______次循环会产生等长的目的基因，该次循环能产生           个这样的片段。

（4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是           。如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同时对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，则形成含有完整抗四环素基因的DNA片段有              种。

（5）如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含          基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是                   。

美国科学家Sanger因发明了链终止DNA测序法而再获诺贝尔奖。通过向DNA复制体系中加入能够终止新链延伸的某种脱氧核苷酸类似物，可以得到各种不同长度的脱氧核苷酸链，再通过电泳呈带(按分子量大小排列)，从而读出对应碱基的位置。下图表示测定DNA新链中腺嘌呤位置的操作方法，据图作答：

(1)操作的第一步是通过加热破坏______________从而使DNA分子的双链打开，在细胞中，这一过程是在___________酶的作用下完成的。

(2)根据图中的模板链，对应合成的最长新链的碱基序列是(自上而下读出)：______________。

(3)要通过以上操作精确地测出DNA链上每一个碱基的位置，电泳分离结果必须能把____________区分开来。

(4)为了能够从电泳结果直接读出模板链中鸟嘌呤的位置，进行以上操作时，应加入什么标记物？__________________。扩增后将产生几种带标记的新链？____________________。