（一）酵母菌是日常生产和生活中应用极其广泛的一种微生物。下图是有关酵母菌的实验操作。请据图回答：

(1)实验中试管用滤膜（封口膜）封住，其目的是___________________________，A和C过程所采用的接种方法分别是______________和______________。

(2)为了扩增酵母菌，可将经D过程接种后的三角瓶置于______培养一段时间，若要测定三角瓶中酵母菌的细胞数，可借助显微镜和血细胞计数板进行计数，下列操作不正确的是____（A.压在方格线上的细胞只计左线和上线上的酵母菌数  B.用滴管取1滴培养液到血细胞计数板的方格区，盖上盖玻片进行计数 

C.如果酵母菌有芽体，因为没有分离成两个子体，要以一个计数 D.计数方格内酵母菌总数应不少于300个）。

(3)G过程利用酵母菌进行果酒制作，为适当提高果酒的生产速率，进气口应____________，制作好的果酒，还可继续生产果醋，用果酒制作果醋的原理是__________________________（写化学反应式）。

（二）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）A具有高产、抗病等优良性质，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需进行一系列试验。部分试验如图所示。

（1）为防止酶切产物自身环化，构建重组DNA分子需用2种限制性核酸内切酶，选择的原则是____。

①Ti质粒内，每种限制性核酸内切酶只有一个切割位点

②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

③酶切后，G基因形成的两个粘性末端序列不相同

④酶切后，Ti质粒形成的两个粘性末端序列相同

A．①③         B．①④        C．②③       D．②④

（2）下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知，细胞脱分化时使用的激素是__________，自交系_____的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体，用愈伤组织做受体细胞是因为其细胞表达___________的能力强，图示目的基因导入受体细胞的方法是_____________。

（3）农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织，需使用含________的选择培养基。

（4）转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K处理后出现蓝色的愈伤组织可能是无农杆菌附着的转化愈伤组织或________________________。

（1）通过图示流程①获取BT抗虫基因需使用____________酶，将其与切割后的质粒重组需使用____________酶；在流程⑤中，细菌经培养不断分裂产生更多的子代细菌，该步骤的主要目的是____________；流程⑦需要用到________________________技术，经过____________过程最终形成植株，其依据的主要原理是____________。

（2）目前多个国家已批准种植转BT基因抗虫玉米供人食用，请结合题意分析其可行的原因是___________________________。

(1)上述限制酶在特定位点切割DNA，其实质是断开DNA分子每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_____________，切割后产生了__________末端。

(2)利用EcoRI和NaeI酶切得某种鱼的抗冻蛋白基因，可与被EcoRI和SmaI酶切后的质粒连接成重组质粒，原因是_________________________________。

(3)重组质粒导入番茄后，欲检测抗冻蛋白基因是否转录出mRNA，需利用______________作探针。

(4)利用抗冻蛋白制备出相应的__________，然后进行抗原—抗体杂交，观察到杂交带出现，尚不足以确定转基因抗冻番茄培育是否成功。因此，还应将转基因番茄___________________________________以确定其耐寒能力是否提高。

图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是_______________

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是_______________________________。

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。

马铃薯是种植广泛的农作物，病毒侵染后导致产量大幅下降，培育脱毒的马铃薯品种是提高产量的有效方法。请分析并回答。

  (1)脱毒马铃薯苗的获得，可采用_____________的方法，此方法的依据是___________和____________。

  (2)为监控脱毒苗的质量。可采用____________________的方法检测病毒的蛋白质。

  (3)研究人员研究了茎尖外植体大小对幼苗的成苗率和脱毒率的影响．实验结果如图。

实验结果表明，茎尖越小，_____________，因此马铃薯脱毒培养中茎尖外植体的适宜大小大约为_____________mm，理由是_________________。

以下为人工合成 reAnti 基因，转入猪成纤维细胞，做成转基因克隆猪的培育过程示意图，请据图回答：

（1）基因工程的核心是 ________  (用序号回答）

（2）基因工程基本工具之一的限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，大多数限制酶的识别序列是由________个核苷酸组成。                                  

（3）在基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、噬菌体衍生物等。

（4）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为 ________。                                                                                                                                  

（5）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞后，要通过 DNA 分子杂交技术，  来检测reAnti基因是否已重组到猪胎儿成纤维细胞的________上。

（6）从猪中取胎儿成纤维细胞，用胰蛋白酶处理，然后进行分散培养。多数细胞生存的适宜 PH 范围是________。

（7）去核前的卵母细胞应培养到________期。其去核后与成纤维细胞通过电刺激后融合，形成重组细胞，再利用物理或化学方法刺激，使之完

成细胞________，在体外培养成重组早期胚胎。

（8）在进行过程⑦操作前，应用激素对受体母猪进行__________处理。

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。

（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有_________个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越_________。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________________。

（4）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________________。

（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入____________酶。
（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_________________________________________________________。

复合型免疫缺陷症(SCID)患者缺失ada基因。利用基因疗法将人正常ada基因转入患者自身T细胞，可改善患者的免疫功能。如图显示该基因疗法的两个关键步骤。回答下列问题：

(1)图中所示获取正常ada基因的方法是______________________，若要大量获取该基因，可通过PCR技术进行扩增。与细胞内DNA复制过程相比，PCR技术的不同点有________________________________。

(2)步骤②是______________________。在该步骤中，病毒作为__________起作用，需使用的工具酶有______________________。

(3)完成步骤②后，在将该T细胞重新输入患者体内之前，还必须完成哪两项操作？____________________________________。

利用基因工程技术，可以使哺乳动物本身变成“批量生产药物的工厂”。科研人员通过乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ医用蛋白，其技术路线如图所示。请回答下列问题：

(1)基因工程的第一步是获取目的基因。目的基因可以从自然界已有的物种中分离，也可以人工合成。可以通过________技术扩增目的基因。利用该技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、____________、4种脱氧核糖核苷酸和模板(人凝血因子Ⅸ基因)。

(2)图中过程①为基因工程的核心，则A表示的结构是________。将A导入绵羊胎儿成纤维细胞的常用方法是________________。筛选整合有目的基因的成纤维细胞时，常用的检测方法是____________。

(3)欲获得绵羊胎儿的单个成纤维细胞，可用________酶处理绵羊组织块。图中所用的去核卵母细胞一般处于____________期。

(4)进行胚胎移植时，代孕母羊需要注射激素，以实现____________。

番茄的成熟、腐烂与乙烯基因表达有关。为了提高番茄的耐贮运性能，科研人员运用基因工程技术减缓乙烯的生成。

（1）以番茄        的数据库为基础，找到乙烯生成相关的基因yx-1。采用        技术可得到大量的yx-1基因，这个基因的表达需要        等不可缺少的调控组件。

（2）如图所示，CRISPR-Cas9是一种新型的基因组定点编辑系统，根据yx-1的序列设计sgRNA(向导RNA),该sgRNA的序列与yx-1基因部分互补配对诱导Cas9n蛋白结合于基因的特异性位点并切割，使yx-1基因发生碱基对的        ，导致基因突变。该过程中，sgRNA和Cas9n共同剪切DNA的作用类似于        的作用。

（3）为了验证靶向能力和编辑效率，可以选取番茄细胞用去        除其细胞壁，得到         ，利用                 技术培育成改良的番茄植株。