图1 表示含有目的基因D 的DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列,图2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamHⅠ、Mbo、Sma 4 种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为

C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题:

(1)图1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 脱氧核糖--_________--脱氧核糖 连接。

(2)若用限制酶Sma完全切割图1 中DNA 片段,产生的末端是 ______ _ 末端,其产物长度为__________________。

(3)若图1 中虚线方框内的碱基对被T-A 碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1 及其对应的DNA 片段,用限制酶Sma 完全切割,产物中共有_____种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是 ________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_________     的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D 不能正确表达,其最可能的原因是 _____________________________________________。

血管内皮生长因子（VEGF)是目前发现的诱导肿瘤血管生成的最强烈的血锌生成因子，针对VEGF生产的抗肿瘤药物，是治疗癌症的一个方向；芝加哥大学的Katherine Knight博士成功地在转基因兔中获得骨髄瘤样肿瘤，经技术改进，能高产量地生产兔单克隆抗体：我国江苏省某公司首次在全球成功开发出人源化兔单抗药物“注射用人源化抗VEGF单克隆抗体”(SIM63),有效打破了跨国公司的技术垄断。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。请回答下列相关问题：

(1)动物细胞在体外培养的技术属于_____________工程，动物细胞体外培养需要满足的条件是：____________、合适的营养、______________、气体环境。由于人们对动物细胞所需的营养物质没有完全搞淸楚，在使用合成培养基时，通常需要加____________等一些天然成分：在培养时除提供细胞所需的O₂外，还需要CO₂，其作用是_____________________ 。

(2)在基因工程中，将目的基因导入动物细胞现今极常用、极有效的方法是________       _。

(3)当VEGF作为抗原进入动物体内时，动物体内的某些B细胞分化为浆细胞，这种浆细胞只分泌针对VEGF的一种抗体，但B细胞在体外培养不会无限增殖，解决这一问题的方法是通过动物细胞融合技术得到杂交瘤细胞，常用的化学诱导融合试剂为____________ ，要分离出杂交瘤细胞,应该

用______________培养基进行筛选，单克隆抗体最主要的优点是它的______________________,并可大量制备。

菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答：

（注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）

（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是_ __，此外还可用                  _      _           作为载体。

（2）构建重组质粒过程需要的酶有限制酶和__________ ，图中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是______________。

（3）为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用__      _处理，使其处于感受态。

（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及__       __和_________的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。

（5）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2 龄幼虫，对照组应饲喂等量的非转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料的混合物，实验结果如下表所示。

据表分析，__                             __差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

回答下列有关基因工程的问题。

下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Ap^r表示抗青霉素的抗性基因，Tc^r表示抗四环素的抗性基因。

A．X－1             B．X－2            C．X－3             D．X－4

（2）若将上图所示X－1、X－2、X－3、X－4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有＿＿＿＿＿＿＿＿     、＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）若将外源的Tc^r基因两端用E2切开，再与用E2切开的X－1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示：

含X－4的细胞数与含X－1的细胞数之比为1：3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？_____________；原因是__________________________。

农业科技工作者在烟草中找到了一抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育抗病棉花品系。请回答下列问题。

（1）为了能把该抗病基因转入到棉花细胞中，常用的载体是__________。

（2）要使载体与该抗病基因连接，首先应使用限制性内切酶（限制酶）进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端是（    ）

（3）切割完成后，采用DNA连接酶将载体与该抗病基因连接，连接后得到的DNA分子称为_____。

（4）再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去_________棉花细胞，利用植物细胞具有的_________性进行组织培养，从培养出的植株中筛选（选择）出抗病的棉花。

（5）转基因棉花获得的_______________是由该表达产物来体现的。

（一）回答与果酒、果醋制作有关的问题。

（1）在酿酒过程中，酵母菌只有在无氧条件下才能进行__________。发酵开始时，发酵瓶内看不到气泡冒出的原因可能是酵母菌的________使发酵瓶内出现负压。

（2）下列各项中，与果酒中的酒精浓度有关的是 ____________________（多选）。

A.发酵时间                                     B.发酵温度

C.培养液中糖的含量                  D.酵母菌对酒精浓度的耐受程度

（3）不同地域所酿制的葡萄酒风味会有一定的差异，出现风味差异的原因除了与当地相应的土壤、气候等地理环境因素和葡萄品种有关外，还可能与不同地域酿酒时所用的_____________________等生物因素有关。

（4）在利用果酒制作果醋过程中，如果已获得醋化醋杆菌菌种，可先在液体培养基中进行·              培养，然后接种到发酵瓶中。发酵瓶下口直角玻璃管内塞有松紧合适的脱脂棉球，其作用是_______________。开始收集果醋前，应检测发酵瓶流出液的_____________________。

（二）毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIF-Ⅱ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转 KIF-Ⅱ 基因的高绒质绒山羊的简单流程如图：

（1）转基因过程用到的工具酶有___________和_______________________。

（2）在过程②中，用_________________处理将皮肤租住分散成单个成纤维细胞。由于人们对动 物细胞所需营养物质还没有完全搞清楚，因此在培养细胞时需在培养基中加入一定量的 __________________________ ，在培养过程中，应将培养瓶置于_____________________中培养。

（3）要获得多只相同的转基因山羊， 可对图中早期胚胎进行___________后进行胚胎移植。

（4）下列有关基因工程的叙述，正确的是______________________  。

A.切割目的基因和载体DNA 时为获得相同的粘性末端，必须用相同的核酸内切酶

B.基因工程的原理是基因重组，其核心是上图中的过程④

C.图示过程获得的转基因绒山羊并不是克隆动物

D.重组表达载体上含有 RNA 聚合酶的识别位点

C．RNA自我复制           D．按照RNA上密码子的排列顺序合成蛋白质

（2）限制酶Sma和限制酶Xma作用的不同点是___________________________________。

（3）图二中的目的基因D需要同时使用Mse酶和Pst酶才能获取，而图一所示的质粒无相应的限制酶切位点。所以在用该质粒和目的基因构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。试写出构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件）：

①首先用_______________酶处理质粒；

②然后用______________酶处理质粒，使被切开的质粒末端连接上相应的脱氧核苷酸；

③再运用DNA连接酶酶处理质粒，形成新的限制酶切位点，即可被_________酶识别。

（4）基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。下图表示运用影印培养法（使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法）检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有___________。从检测筛选的结果分析，含目的基因的是________（填编号）菌落中的细菌。

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，请回答下列问题：

（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前、后，分别含有____、____个游离的磷酸基团。

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越_____。

（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是__________________________。

（4）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止____________________。

（5）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了___________________________________。

（6）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在____________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。

回答有关基因工程的问题。

（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生__________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________（填“相同”或“不同”）黏性末端的限制酶。

（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是______________________。以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为____________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成__________，常用抗原—抗体杂交技术。

（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的__________上。