R－7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA，可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3′－UTR)结合，进而影响基因的表达。为研究R－7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达，科研人员将基因B中对应3′－UTR的DNA片段与荧光素酶基因(R－7不影响荧光素酶基因的表达)重组后导入家蚕胚胎细胞观察其表达结果。请回答：

(1)利用PCR技术扩增基因B对应3′－UTR的DNA片段，应先依据该基因的一段核苷酸序 列合成______________________。

(2)利用_____________________________________酶可将上述DNA片段插入荧光素酶基因表达载体(如图)上的位点_____________，构建重组载体。

(3)将重组载体与R－7共同导入家蚕胚胎细胞，同时应设置两个对照组，即将_____________________、_____________________分别导入两组家蚕胚胎细胞。

(4)科研人员分别从实验组和对照组细胞中提取________________，经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下，荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并发出荧光)，其结果如图。

(4)依据实验结果可推断，R－7影响基因B的表达，即通过遵循______原则，R－7与基因B所转录的mRNA的3′－uTR结合，进而__________(填"促进"或"抑制")基因B的表达。

转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示。图中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等为限制酶，质粒和抗病基因上的箭头表示限制酶的切割位点。下表示四种限制酶的识别序列及酶切位点。

（1）若要获得抗病基因，不能用限制酶SmaⅠ对图中对应的位点进行切割，因为若在SmaⅠ位点进行切割会_________________。要获得含抗病基因的重组质粒可用_____和_______限制酶切割质粒。它们能使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的____________________ 断开。

（2）卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长。欲利用含卡那霉素的培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，重组质粒中应同时含有________基因，作为标记基因。

（3）将重组DNA分子导入香蕉受体细胞的常用方法是________法。

（4）为了进一步确定抗病基因是否插入香蕉细胞染色体，可采用的检测方法是_______________。目的基因进入受体细胞后的表达过程中，RNA聚合酶需与______________识别和结合，从而驱动转录过程。

（5）图中导入抗病基因的香蕉组织块一般需要通过____________________的方法，可培育成能表现新性状的植株，该方法依据的原理是：__________________________。

用小鼠进行DNA重组研究中形成的“基因敲除”技术，能“敲除”DNA分子上的特定基因。该技术的主要过程如下：

第一步：分离小鼠胚胎干细胞，这些细胞中含有需要改造的基因，称“靶基因”。

第二步：获取与“靶基因”同源的DNA片段，利用特定技术在该DNA片段上插入neo^R基因（新霉素抗性基因）成为突变DNA（如图），使该片段上的靶基因失活。

第三步：将插入neo^R基因（新霉素抗性基因）的靶基因转移入胚胎干细胞，再通过同源互换，用失活靶基因取代两个正常靶基因中的一个，完成对胚胎干细胞的基因改造。

第四步：将第三步处理后的胚胎干细胞，转移到特定培养基中筛选培养。

其基本原理如下图所示：

（1）第二步中neo^R基因插入靶基因使用的工具酶是________。neo^R基因不仅能使靶基因失活，还是________；“靶基因失活”的含义是________________________________。

（2）从研究者成功获得如图所示的“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞，到将该细胞培育成“基因敲除”小鼠，运用到的生物技术有________、________、________等。

（3）科学家可以通过“基因敲除”技术来治疗疾病，上题中获得的基因敲除小鼠，能否直接用来研究基因功能并说明原因______

________________________________，______________________________________。

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_____连接。

​(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是_____末端，所断开的化学键叫____键。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有____种不同长度的DNA片段。
(4)为了提高试验成功率，需要通过___技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝。
(5)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_____。在导入重组质粒后，为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，需要用添加_____的培养基进行培养。

(6)目的基因D能“嫁接”到质粒上，其原因是_____（从DNA分子水平分析），在选出的大肠杆菌内基因D能成功表达的原因是_____。

绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV 蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是具有重要经济价值的双子叶植物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV 的烟草，主要流程如下图所示。

(1)理论上，基因组文库与cDNA文库中含的基因区别是______________。

(2)科学家从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中①过程表示_______。

(3)④过程将重组Ti质粒导入烟草体细胞的常用方法是_______。

(4)过程⑥可采取_______的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过_______的方法来确定植株是否具有抗性。

下图是利用奶牛乳汁生产人类血清白蛋白的图解，根据下图回答：

(1)在基因工程中，在②进入③之前要用_______________等工具来构建基因表达载体,基因的表达载体成分除了启动子之外还有_____________,将构建好的表达载体导入③的常用方法是__________________。

(2)从③到④的过程中一般利用未受精的去核卵细胞为受体，而不用普通的体细胞，原因是_________________。

(3)④到⑤的过程中正确的操作方法____，把⑤送入⑥的最佳时期是___________。

(4)⑦是⑥生出的后代，那么⑦的遗传性状和_______________最相似，要实现⑦批量生产血清白蛋白，则要求③的性染色体是_____。

(5)可以从哺乳动物的______________________中分离出来ES或EK细胞。这类细胞的形态特征有_______________________。

下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。

据图回答：

(1)(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在______酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_____的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的____________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的_____________序列，再通过化学方法合成所需基因。

(2)利用PCR技术扩增基因A时，需要在反应体系中添加的有机物质有_____、______、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为__________________________。

(4)在基因工程中，常用Ca²⁺处理D，其目的是________________________________________。

请利用所学知识回答基因工程方面的有关问题：

（1）基因工程所用的生物学原理为_________________，其操作的核心步骤为_________________，在操作的过程中没有涉及碱基互补配对的步骤为_________________，获取目的基因的来源有_________________和_________________。

PCR过程除需要适宜的温度、模板DNA、引物，还需要_____________、_____________等条件才能扩增出大量DNA片段。

（3）将目的基因导入植物细胞时，采用最多的方法是_________________。目的基因进入受体细胞后的表达过程中，RNA聚合酶需与_________________识别和结合，从而驱动转录过程。最终目的基因是否成功表达，常用_____________方法进行检测，若出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。

（4）蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，其基本流程为_________________、________________、________________、找到对应的脱氧核苷酸序列。

　：

(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如图所示。为防止酶切片段的自身连接，可选用的限制酶组合是________或________。

A．①②　　B．①③　　C．②④　　D．③④

(2)设置菌株Ⅰ为对照，是为了验证__________________不携带纤维素酶基因。

(3)纤维素酶基因的表达包括________和________过程。与菌株Ⅱ相比，在菌株Ⅲ、Ⅳ中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有________________。

(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，菌株________不能存活，原因是____________________________________________________。

(5)在利用纤维素生产酒精时，菌株Ⅳ更具优势，因为导入的重组质粒含有__________，使分泌的纤维素酶固定于细胞壁，减少因培养液更新而造成的酶的流失，提高酶的利用率。

北极比目鱼中有抗冻基因，下图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图，请回答：

（1）过程②中常需要使用限制酶和DNA连接酶，既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是_______________。

（2）为使过程①获取的目的基因在番茄细胞中能够表达，在构建表达载体时，需要将目的基因插入_______，并且需在目的基因的首端和尾端分别加入_________，________。

（3）此题中将目的基因导入受体细胞的方法是_____________。

（4）要检测番茄的DNA上是否插入抗冻基因，应以______________为探针，与番茄基因组DNA杂交；要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中正确表达，应通过_____________法检测转基因番茄植株中该基因的表达产物是否呈阳性。