基因工程的整个过程包括工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分。回答有关问题：

（1）基因工程操作中需要使用的工具酶是                            。

（2）基因工程中将外源基因（例如抗除草剂基因）导入受体细胞（例如玉米）中的运载体包括                   （写出2种），运载体必须具备的功能，除了能将外源基因转移到受体细胞中，还必须具备能为外源基因提供在受体细胞中的                  能力。

（3）农杆菌因具有含T-DNA（可转移的DNA）的Ti质粒备受青睐。能将目的基因导入受体细胞的重组Ti质粒又称为              ，其组成至少包括5个不可缺少的DNA序列：除目的基因、终止子外，还有                            （缺一不可）。

（4）获得目的基因（抗除草剂基因）的方法有：以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是                            ；又可通过技术扩增目的基因；还可通过化学方法直接获得              。检测抗除草剂基因导入转基因生物细胞后，是否能稳定维持和表达其遗传特性的方法是                            。

去年冬季我国北方再次爆发流感，专家指出接种流感病毒疫苗仍是预防的有效措施。流感病毒为RNA病毒，M基因编码流感病毒表面抗原（M蛋白）。请回答下列问题：

（1）由病毒RNA通过________________可获得病毒DNA，若要通过PCR技术扩增M基因，前提是设计M基因对应的_____________ 。

（2）构建M基因表达载体所用的工具酶是 ____________________ 。若要将M基因表达载体导入到大肠杆菌细胞内，以大量生产疫苗，通常先用钙离子处理大肠杆菌，其目的是 _______________________。检测M基因是否转录出mRNA的具体方法是使用__________________与提取出的______做分子杂交。

（3）新型疫苗—“DNA疫苗”是将含M基因的重组表达载体直接导入人体内，在人体细胞内通过M基因的表达产生__________，刺激机体通过免疫过程产生_________，以提高机体的免疫能力。

真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：

(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。

(2)若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是_____________________。

(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________(答出两点即可)等优点。

(4)基因工程中获取的目的基因主要是指                            基因。

(5)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是                              （写出两点即可）。

回答下列有关基因工程的问题：

（1）在基因工程中，获取目的基因的方法包括:①从基因文库中获取目的基因，②利用__________扩增目的基因，③____________。

（2）在基因表达载体中，启动子是_______________识别并结合的部位。

（3）将目的基因导入微生物常用______________处理受体细胞，使之变成感受态细胞。

（4）基因工程实施时不能将目的基因连接到运载体上的标记基因中，原因是__________________。

下图是利用转基因技术生产干扰素的简化流程。请分析回答：

（1）过程①使用的         酶能使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的          （化学键）断开。过程②需要用到        酶。运载体的黏性末端与含目的基因的DNA片段的黏性末端上的碱基按照碱基互补原则通过      （化学键）而结合。

（2）图中形成A的过程是_________________（是基因工程的核心步骤），它重组成功的物质基础是干扰素基因的DNA与细菌质粒DNA的结构组成相同。

（3）A上应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动干扰素基因转录，该部位称为__________ 。为直接检测干扰素基因是否转录，可从细胞中提取  与用放射性同位素标记的____________

____作探针进行分子杂交。

（4）利用PCR扩增仪大量扩增目的基因的前提是目的基因上有一段是已知的核苷酸序列，以便根据这一序列合成      ，除了该物质和目的基因外，扩增仪中还需加入四种脱氧核苷酸和           酶，并适时调整温度，才能使目的基因数量成指数式增长。

（5）在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是—G↓GATCC—。请画出质粒（部分DNA片段如下图）被切割后形成黏性末端：

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题

（1）图中cDNA文库         基因组文库（选填“大于”或“等于”或“小于”）。

（2）①过程提取的DNA需要         的切割。

（3）为在短时间内大量获得目的基因，可用的技术是       ，其原理是                。该反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg²⁺）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、_____________和_________________。

（4）目的基因获取之后，需要进行基因表达载体的构建，基因表达载体的组成必须有______         及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。

（5）将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是         ，检测目的基因是否导入受体细胞、是否翻译出相关的蛋白质时所用的方法分别是_________________、_________________技术进行检测。

凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，研究人员利用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中并使之表达。下图表示EcoRI、BamHI、PstI三种限制酶在质粒和含凝乳酶基因的外源DNA片段上的切割位点。请回答下列问题：

（1）根据图中EcoRI、BamHI、PstI三种限制酶的切割位点分析，该工程中最不适宜用来切割外源DNA获取目的基因的限制酶是___________________________，原因是___________________________。将切割后的质粒和目的基因连接起来需要_______________________酶。构建好的重组质粒在目的基因前要加上特殊的启动子，它是___________________________识别和结合的部位。

（2）工业化生产过程中，若采用重组大肠杆菌生产凝乳酶，该过程中将目的基因导入大肠杆菌前，常常用___________________________处理细胞，使之处于一种能___________________________的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。

（3）研究发现，如果将该凝乳酶第20位和第24位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2倍。科学家可以生产上述高效凝乳酶的现代生物工程技术是___________________________。该生物工程技术对蛋白质结构的设计和改造，必须通过基因来完成，原因是___________。

我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪在东北农业大学的种猪场自然分娩产出，这标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平。下图为我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的培育过程示意图，请据图回答：

（1）过程①必需用到的酶是                                       

（2）重组质粒除了带有绿色荧光蛋白基因以外，还必须含有启动子、终止子和______________       才能构成一个完整的基因表达载体

（3）为了获得更多的猪卵母细胞，可通过对母猪注射促性腺激素的方法，做_________处理，并将所采集到的卵母细胞在体外培养到                        期即可通过显微操作将其细胞核去除。

（4）我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的培育过程运用了哪些现代生物技术_        _________________________________________________________

随着科学技术的发展，化学农药产品和品种逐年增加，但害虫的抗药性也不断增强，对农作物的危害仍然很严重。针对这些情况，科学家开展了“转基因抗虫棉”的科技攻关研究，成功地将抗虫基因导入棉花细胞中，得到的棉花新品种对棉铃虫的毒杀效果高达80％以上，请完成下列问题：

（1）转基因生物引发的安全性问题包括          、          、          三方面。

（2）苏云金芽孢杆菌的抗虫基因之所以能“嫁接”到棉花中去，其结构基础是                      ；它能够在棉花细胞中发挥作用，说明生物共用一套       

（3）该项科技成果在环境保护上的重要作用是                      。

（4）将苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因导入棉花内，使棉花形成新的性状，这种变异属于________________，科学家预言，此种“转基因抗虫棉”独立种植若干年以后，也将出现不抗虫的植株，此现象的发生可能是                 的结果。

（5）对待转基因技术的利弊，正确的做法应该是                           。

（6）你认为转基因抗虫棉是否存在安全性问题，请说明理由。                                                                    。