2015年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获奖。工业上青蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路。科学家先通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现该高产植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是___________________，需要的条件有___________________________________________。

（2）如果用青蒿某个时期mRNA反转录产生的双链cDNA片段，该双链与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做青蒿的________________。

（3）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答：

用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因________________________________________________________________________，构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是_______________________________识别结合位点。

（4）检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取________________________________________技术。

(2) 图中过程(2)是基因工程的第二步，即：                            。

(3) 图中过程(3)是用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒感染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用       处理，使细胞处于能吸收外源DNA的生理状态，这种细胞称为__________细胞，再与溶于缓冲液的表达载体混合，在一定的温度下完成转化。

(4)检测大肠杆菌B是否导入了质粒或重组质粒，可采用的方法是将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A或重组质粒，反之则没有导入。因为普通质粒A和重组质粒上都有                        。

(5)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，出现的现象是有的能生长，有的不能生长。其中导入             的细菌不能生长。

(6)应用___________________杂交技术可检测工程菌是否表达出人的生长激素。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)cDNA文库属于_____基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_____反转录产生的cDNA片段，与________连接后储存在一个受体菌群中。

(2)切割DNA分子的工具是_______________，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断开，形成黏性末端或平末端。

(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是________DNA连接酶。

(4)如果受体细胞是大肠杆菌，需要用________处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。

干扰素是动物或人体细胞受病毒感染后产生的一类糖蛋白，具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。回答下列问题：

(1)干扰素的作用机理是：干扰素作用于宿主细胞膜上的相应受体，激活细胞核中基因表达产生多种抗病毒蛋白，其中有些蛋白可通过激活____________使病毒的RNA水解；有些则可与__________(细胞器)结合，通过抑制病毒多肽链的合成发挥抗病毒作用。

(2)利用基因工程产生干扰素的方法之一：利用________酶将干扰素基因与牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件连接在一起构建基因表达载体，采用__________的方法导入牛的受精卵细胞中，经胚胎早期培养至________________期，移植入母体内发育成熟，即可获得能产生干扰素的转基因牛。

(3)由于干扰素在体外保存困难，可利用蛋白质工程对干扰素进行改造，基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

基因工程的整个过程包括工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分。回答有关问题：

（1）基因工程操作中需要使用的工具酶是                            。

（2）基因工程中将外源基因（例如抗除草剂基因）导入受体细胞（例如玉米）中的运载体包括                   （写出2种），运载体必须具备的功能，除了能将外源基因转移到受体细胞中，还必须具备能为外源基因提供在受体细胞中的                  能力。

（3）农杆菌因具有含T-DNA（可转移的DNA）的Ti质粒备受青睐。能将目的基因导入受体细胞的重组Ti质粒又称为              ，其组成至少包括5个不可缺少的DNA序列：除目的基因、终止子外，还有                            （缺一不可）。

（4）获得目的基因（抗除草剂基因）的方法有：以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是                            ；又可通过技术扩增目的基因；还可通过化学方法直接获得              。检测抗除草剂基因导入转基因生物细胞后，是否能稳定维持和表达其遗传特性的方法是                            。

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请回答下列问题：

(1)从人体组织中提取EPO的mRNA，通过逆转录得到________，再通过PCR技术获得大量EPO基因。

(2)供体母鼠通常情况下每次排卵8～12枚，为使其超数排卵，需注射________激素以排出更多的卵子，培养到________期，与获能的精子相遇时，精子首先发生________反应，穿越放射冠和透明带，完成体外受精。

(3)①过程构成了基因表达载体，内部包括不可缺少的组成部分，其中______能驱动基因的转录。

(4)采用________技术，将重组表达载体导入小鼠受精卵中，将受精卵移入发育培养液中继续培养。培养液成分除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及________等物质。

(5)当胚胎发育至________时期，向受体移植，为获得更多个转基因胚胎，要将________均等切割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。此外，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。

(6)桑基鱼塘生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成无废弃物农业，这主要遵循了生态工程________的原理。我国西北一些地区年降雨量较少，适宜种植灌木和草，却被硬性规定种植属于乔木的杨树，致使许多地方的杨树长成半死不活状，结果防护林成为残败的“灰色长城”。其失败的原因主要是违背了____________原理。

下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，lacZ正常表达菌落呈蓝色，未表达的普通菌落呈白色。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对）。回答下列问题：

（1）用图中的目的基因与质粒构建基因表达载体时，应该选择质粒__________（填“质粒A”、“质粒B”或者“质粒C”），选择的限制酶是______________。

（2） 转录的起始部位称为              ，是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶_________        _________的部位。

（3）如果选择的质粒与目的基因重组成功，并且在受体细胞中能正常表达，则所形成的重组质粒用EcoR I完全酶切，并进行电泳观察，可出现的片段长度有__________或______________。

（4）导入大肠杆菌后，为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，在普通琼脂培养基中还需加入__________，形成的菌落颜色为______________。

完成下列相关填空

（一）某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，开展了产该酶菌株的筛选、酶的固定化及其特性分析研究，其流程如下图所示。

（1）土壤悬液先经80℃处理15分钟，其目的是筛选出             。

（2）在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行            ，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。培养后观察到单菌落，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与           强弱相关。

（3）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中         的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高                的利用率。

（4）利用物理或化学方法将植酸酶固定在          的介质上称为固定化酶。实验过程涉及两次蒸馏水洗涤反应柱的操作，其中第一次洗涤的目的是除去             。

（二）下图为绵羊多莉克隆过程，请回答有关问题。

（5）步骤1中若要获得较多数量的卵细胞，通常对母羊注射相关激素使其超数排卵。步骤2可通过降低           浓度，实现对乳腺细胞的营养限制性培养，可以得到大量的          期细胞，从而实现细胞分裂同步化。

（6）步骤3中科研人员采用         技术进行细胞融合，步骤4通过胚胎体外培养获得胚胎，待发育至              胚胎时进行移植，通常移植至代孕母羊的          部位。

（7）若要将目的基因导入乳腺细胞中，在扩增目的基因时，除利用PCR技术外，还可将目的基因所在的重组载体导入大肠杆菌中，利用大肠杆菌  ▲ 使其扩增。

（8）为获得大量的上述克隆羊，可用胚胎成纤维细胞进行体细胞克隆。因为胚胎成纤维细胞可进行           培养，理论上可获得无限只克隆羊。

基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答： 

（1）图中A是______；在基因工程中，②拼接过程所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是____DNA连接酶。只能连接黏性末端的是_____DNA连接酶。 

（2）在上述基因工程的操作过程中，遵循碱基互补配对原则的步骤有_____。（用图解中序号表示） 

（3）将基因表达载体导入动物的受精卵中常用_____法。如果受体细胞是大肠杆菌，需要用____处理细胞，使之成为_____，才能吸收DNA分子。

（4）研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源可以看成是_____。 

（5）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明_____，若把目的基因导入该植物的叶绿体DNA中，则其产生的配子中____（填“一定”或“不一定”）含有该基因。

（6）假如用得到的二倍体转基因抗枯萎病植株自交，子代中抗病与不抗病植株的数量比为3：1时，则可推测该抗病基因整合到了____上（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。