（I）大肠杆菌是与我们日常生活联系非常密切的细菌，请回答有关检测饮用水中大肠杆菌的问题：

（1）检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为_____________。判断下面所示的4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是__________________。

（2）用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？__________（填“需要”或“不需要”），其原因是需要判断培养基___________，对于固体培养基应采用的检测方法是将________________的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。

（3）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________（填“消毒”或“灭菌”）处理；操作者的双手需要进行清洗和________________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能损伤它的____________的结构。

（4）检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过________________处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。

35.（II）   根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。

AATTC……G

G……CTTAA

为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是________。

（3）反转录作用的模板是____________，产物是__________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。

（4）基因工程中除质粒外，________和______也可作为载体。

（5）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_________________________。

(2) 图中过程(2)是基因工程的第二步，即：                            。

(3) 图中过程(3)是用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒感染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用       处理，使细胞处于能吸收外源DNA的生理状态，这种细胞称为__________细胞，再与溶于缓冲液的表达载体混合，在一定的温度下完成转化。

(4)检测大肠杆菌B是否导入了质粒或重组质粒，可采用的方法是将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A或重组质粒，反之则没有导入。因为普通质粒A和重组质粒上都有                        。

(5)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，出现的现象是有的能生长，有的不能生长。其中导入             的细菌不能生长。

(6)应用___________________杂交技术可检测工程菌是否表达出人的生长激素。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)cDNA文库属于_____基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_____反转录产生的cDNA片段，与________连接后储存在一个受体菌群中。

(2)切割DNA分子的工具是_______________，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断开，形成黏性末端或平末端。

(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是________DNA连接酶。

(4)如果受体细胞是大肠杆菌，需要用________处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。

​

请回答下列问题：

(1)从人体组织中提取EPO的mRNA，通过逆转录得到________，再通过PCR技术获得大量EPO基因。

(2)供体母鼠通常情况下每次排卵8～12枚，为使其超数排卵，需注射________激素以排出更多的卵子，培养到________期，与获能的精子相遇时，精子首先发生________反应，穿越放射冠和透明带，完成体外受精。

(3)①过程构成了基因表达载体，内部包括不可缺少的组成部分，其中______能驱动基因的转录。

(4)采用________技术，将重组表达载体导入小鼠受精卵中，将受精卵移入发育培养液中继续培养。培养液成分除一些无机盐和有机盐类外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及________等物质。

(5)当胚胎发育至________时期，向受体移植，为获得更多个转基因胚胎，要将________均等切割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。此外，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行________。

(6)桑基鱼塘生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成无废弃物农业，这主要遵循了生态工程________的原理。我国西北一些地区年降雨量较少，适宜种植灌木和草，却被硬性规定种植属于乔木的杨树，致使许多地方的杨树长成半死不活状，结果防护林成为残败的“灰色长城”。其失败的原因主要是违背了____________原理。

基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用。基因工程基本操作流程如下图，请据图分析回答： 

（1）图中A是______；在基因工程中，②拼接过程所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是____DNA连接酶。只能连接黏性末端的是_____DNA连接酶。 

（2）在上述基因工程的操作过程中，遵循碱基互补配对原则的步骤有_____。（用图解中序号表示） 

（3）将基因表达载体导入动物的受精卵中常用_____法。如果受体细胞是大肠杆菌，需要用____处理细胞，使之成为_____，才能吸收DNA分子。

（4）研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源可以看成是_____。 

（5）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明_____，若把目的基因导入该植物的叶绿体DNA中，则其产生的配子中____（填“一定”或“不一定”）含有该基因。

（6）假如用得到的二倍体转基因抗枯萎病植株自交，子代中抗病与不抗病植株的数量比为3：1时，则可推测该抗病基因整合到了____上（填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。  

以现有大豆品种作为受体材料，利用基因工程技术，获得转基因植株，分析其对疫霉根腐病的抗病性，筛选出抗病大豆新株（品）系。请据此回答问题：

（1）基因工程的核心技术是____________ ，该过程用到的酶有_________________________。

（2）在用土壤农杆菌介导时往往要用 _____处理土壤农杆菌，使之成为________细胞，然后将它们在缓冲液中混合培养以完成转化过程。

（3）抗性植株的分子生物学检测是基因工程成功与否的重要一环，其中检测目的基因是否插入受体细胞染色体的DNA的方法是 _________________ ，其个体生物学水平的检测方法为_____________________ 。

（4）将转基因大豆细胞培养成转基因大豆植株，需要应用的工程技术是_____________________，其依据的原理是 _______________。

基因工程是从分子水平对基因进行操作从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：

（1）构建基因组文库的一般步骤：

①提取某种生物体内的___________，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；

②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体；

③重组载体导入到__________的群体中储存，基因组文库构建完成。

（2）与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是______________。

（3）载体与DNA片段结合前，需要使用同种的限制酶处理。其目的是____________ 。

（4）受体菌在导入重组载体之前，常用_________处理，提高导入的成功率。

图1 表示含有目的基因D 的DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列,图2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamHⅠ、Mbo、Sma 4 种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为

C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题:

(1)图1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 脱氧核糖--_________--脱氧核糖 连接。

(2)若用限制酶Sma完全切割图1 中DNA 片段,产生的末端是 ______ _ 末端,其产物长度为__________________。

(3)若图1 中虚线方框内的碱基对被T-A 碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1 及其对应的DNA 片段,用限制酶Sma 完全切割,产物中共有_____种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是 ________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_________     的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D 不能正确表达,其最可能的原因是 _____________________________________________。

请回答胚胎工程和基因工程方面的问题：

（1）应用胚胎工程技术可以培育出“试管牛”。试管牛的培育需经过体外受精、__________、_____________以及在母体中发育和产出等过程。

（2）通常奶牛每次排出一枚卵母细胞，采用激素处理可使其一次排出多枚卵母细胞，常使用的激素是__________。

（3）利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。基因工程的四个基本操作步骤是_____    _____、基因表达载体的构建、____   ______和____   ______。若要获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、__________、__________、__________和复制原点等。为获得能大量产生人干扰素的转基因牛，该基因表达载体应导入的受体细胞是__________。