回答下列问题：

（1）博耶( H. Boyer)和科恩(S. Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____(答出两点即可)。

（2）体外重组的质粒可通过Ca²⁺参与的_______方法导入大肠杆菌细胞：而体外重组的噬菌体DNA通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________。

（3）真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加______的抑制剂。

生物技术已经渗入到了我们生活的方方面面，例如：

（1）目前临床用的胰岛素生效较慢，科学家将胰岛素B链的第28和29个氨基酸调换顺序，成功获得了速效胰岛素。生产速效胰岛素，需要对___________（胰岛素/胰岛素mRNA/胰岛素基因）进行定向改造，它属于第二代基因工程即________。将改造后的分子导入受体大肠杆菌，一般需要用_______处理大肠杆菌细胞，使之成为__________细胞。

（2）若某对夫妇结婚后发现妻子双侧输卵管堵塞，无奈需进行试管婴儿技术，该技术包括_______________________。（写出两项即可）

（3）连年种植单一品种造成病虫害增加主要违反了____________原理。各种粪便作为沼气发酵的原料，这体现了生态工程的_________________原理。

（1）过程①中将修饰后的CHS基因与Ti质粒连接成重组Ti质粒的酶称为               。这种酶主要有两类，一类是从T4噬菌体中分离得到的，另一类是从大肠杆菌中分离得到的。这两类酶都能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的                 键。

（2）图中将修饰后的CHS基因导入苦荞体细胞的方法称为                   ，除此外还可以利用的方法有                    。对过程②操作前，需先用Ca²⁺处理农杆菌，使其成为             细胞。

（3）检测转基因苦荞培育是否成功，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的

                 含量或测定细胞中CHS含量进行鉴定。

基因工程的整个过程包括工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分。回答有关问题：

（1）基因工程操作中需要使用的工具酶是                            。

（2）基因工程中将外源基因（例如抗除草剂基因）导入受体细胞（例如玉米）中的运载体包括                   （写出2种），运载体必须具备的功能，除了能将外源基因转移到受体细胞中，还必须具备能为外源基因提供在受体细胞中的                  能力。

（3）农杆菌因具有含T-DNA（可转移的DNA）的Ti质粒备受青睐。能将目的基因导入受体细胞的重组Ti质粒又称为              ，其组成至少包括5个不可缺少的DNA序列：除目的基因、终止子外，还有                            （缺一不可）。

（4）获得目的基因（抗除草剂基因）的方法有：以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是                            ；又可通过技术扩增目的基因；还可通过化学方法直接获得              。检测抗除草剂基因导入转基因生物细胞后，是否能稳定维持和表达其遗传特性的方法是                            。

下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，lacZ正常表达菌落呈蓝色，未表达的普通菌落呈白色。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对）。回答下列问题：

（1）用图中的目的基因与质粒构建基因表达载体时，应该选择质粒__________（填“质粒A”、“质粒B”或者“质粒C”），选择的限制酶是______________。

（2） 转录的起始部位称为              ，是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶_________        _________的部位。

（3）如果选择的质粒与目的基因重组成功，并且在受体细胞中能正常表达，则所形成的重组质粒用EcoR I完全酶切，并进行电泳观察，可出现的片段长度有__________或______________。

（4）导入大肠杆菌后，为了筛选出含目的基因的大肠杆菌，在普通琼脂培养基中还需加入__________，形成的菌落颜色为______________。

近期，中国和韩国的科学家利用某项技术去掉了猪体内的肌肉生长抑制基因，然后把这些“改造过的基因”植入猪的受精卵中，进而发育成肌肉细胞生长不受限制的“肌肉猪”。回答下列问题：

（1）利用体外受精的方法获得猪的受精卵时，采集卵母细胞时，可用__________激素处理母猪，使其排出更多的卵子，然后从________中冲取卵子，与获能的精子在体外受精。

（2）“改造过的基因”需与________等拼接成基因表达载体再导入受精卵中。

（3）将具有“改造过的基因”的受精卵细胞培育成“肌肉猪”需利用_________________等胚胎工程技术。胚胎工程技术最后一道工序在生产实践中的最大意义是__________。

去年冬季我国北方再次爆发流感，专家指出接种流感病毒疫苗仍是预防的有效措施。流感病毒为RNA病毒，M基因编码流感病毒表面抗原（M蛋白）。请回答下列问题：

（1）由病毒RNA通过________________可获得病毒DNA，若要通过PCR技术扩增M基因，前提是设计M基因对应的_____________ 。

（2）构建M基因表达载体所用的工具酶是 ____________________ 。若要将M基因表达载体导入到大肠杆菌细胞内，以大量生产疫苗，通常先用钙离子处理大肠杆菌，其目的是 _______________________。检测M基因是否转录出mRNA的具体方法是使用__________________与提取出的______做分子杂交。

（3）新型疫苗—“DNA疫苗”是将含M基因的重组表达载体直接导入人体内，在人体细胞内通过M基因的表达产生__________，刺激机体通过免疫过程产生_________，以提高机体的免疫能力。

（1）PCR技术利用了_________原理解决了打开DNA双链的问题，从一种细菌中分离到_______，解决了DNA聚合酶失活的新问题。

（2）利用PCR技术从基因文库中提取目的基因时，首先要根据目的基因的核苷酸序列设计并合成出2种引物。在第_________轮开始出现目的基因片段。

（3）试管动物技术正广泛应用于畜牧业生产，此技术中从母牛体内获得的卵母细胞需要到____________________(时期)才能与精子结合。在体外培养受精卵时，需要满足以下条件：_______________、营养、温度和pH以及气体环境。

（4）将外源基因导入小鼠受精卵后，外源基因会随机插入到小鼠受精卵DNA中。这种受精卵有的可发育成转基因小鼠，有的却死亡。请分析:因外源基因的插入导致受精卵死亡的最可能原因_________________。