下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线．图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉索抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点．

​（6）基因工程的四个操作步骤是___________、____________、____________、和____________。

I.我国科研人员克隆了100多个重要基因，取得了抗虫棉、抗虫玉米、耐除草剂大豆等一批重大转基因成果。请回答下列问题：

（1）为避免Bt毒蛋白基因通过花粉传播进入其它植物，一般将Bt毒蛋白基因转入棉花细狍的__________（选择填入“细胞核”或“叶绿体”）。

（2）每一种Bt毒蛋白的杀虫范围有限，对现有的毒蛋白进行_______，使其具有更广杀虫范围，属于___________（生物工程）的范围。

（3）随着转基因成果的不断涌现，人们对转基因生物的安全性的关注与日俱增，在食物安全、生物安全和___________三个方面发生了激烈争论。

II.关注生态工程的建设：

（1）与传统的工程相比,生态工程是一类少消耗、__________、可持续的工程体系。

（2）“无废弃物农业”是我国古代传统农业的辉煌成就之一,也是生态工程最早和最生动的一种模式，该模式主要遵循生态工程的______________原理。我国西北一些地区年降雨量少，适宜种植灌木和草，却被硬性规定种植属于乔木的杨树，致使许多地方的杨树长成半死不活状，结果防护林成了残败的“灰色长城”。其失败的原因主要是违背了___________________原理。

（3）下面的结构示意图中，能体现系统学和工程学原理的是(　　)

T₄溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T₄溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T₄溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。请回答问题：

（1）上述操作涉及的技术属于________工程，该技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→________→________→找到相应的脱氧核苷酸序列。

（2）在确定目的基因的碱基序列后，可通过________的方法获取目的基因，再利用________技术进行扩增。用这种方法获得的目的基因与从生物体内直接提取的目的基因在结构上的区别是________。

（3）在将目的基因导入受体细胞前，要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有________、________以及标记基因等。

T₄溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T₄溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T₄溶菌酶第三位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。请回答问题：

（1）上述操作涉及的技术属于________工程，该技术的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→________→________→找到相应的脱氧核苷酸序列。

（2）在确定目的基因的碱基序列后，可通过________的方法获取目的基因，再利用________技术进行扩增。用这种方法获得的目的基因与从生物体内直接提取的目的基因在结构上的区别是________。

（3）在将目的基因导入受体细胞前，要构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有________、________以及标记基因等。

科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图1：

（1）步骤①中，在核移植前应去除卵母细胞的                        。

（2）将基因导入ES细胞而不是导入到上皮细胞是因为                                              。

（3）步骤③中，需要构建含有干扰素基因的                        。构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取                      作为引物。对干扰素基因片段和质粒进行酶切时，可选用限制酶的组合为                      。

（4）将步骤③获得的ES细胞在荧光显微镜下观察，选择发                     色荧光的细胞进行体外诱导。为检测干扰素基因是否导入受体细胞，可以采用                      方法检测。

下图为某转基因小鼠培育过程示意图，①－⑥表示相关过程。请回答：

（1）为了使供体母鼠超数排卵，过程①注射的A物质是________。

（2）取自公鼠附睾中的精子只需放入获能培养液中培养一段时间后，就可进行体外受精，若是牛、羊等提供的精子，则需放入含           的溶液中诱导其获能。

（3）图中过程⑥称为________，为使代孕母鼠与供体母鼠生殖器官的生理变化相同，此前需对代孕母鼠作________处理。

（4）采用胚胎分割移植的方法可获得较多基因组成相同的转基因小鼠，操作时需选择发育到桑椹胚或囊胚期的胚胎进行。若选用囊胚期的胚胎，操作过程需要特别注意的问题是________。ES细胞是由囊胚或原始性腺中分离出的一类细胞，该类细胞在        上，或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。

请利用所学知识回答基因工程方面的有关问题：

（1）基因工程所用的生物学原理为_________________，其操作的核心步骤为_________________，在操作的过程中没有涉及碱基互补配对的步骤为_________________，获取目的基因的来源有_________________和_________________。

（2）利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物A、B为单链DNA片段，它是目的基因子链合成延伸的基础。

PCR过程除需要适宜的温度、模板DNA、引物，还需要_____________、_____________等条件才能扩增出大量DNA片段。

（3）将目的基因导入植物细胞时，采用最多的方法是_________________。目的基因进入受体细胞后的表达过程中，RNA聚合酶需与_________________识别和结合，从而驱动转录过程。最终目的基因是否成功表达，常用_____________方法进行检测，若出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。

（4）蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，其基本流程为_________________、

________________、________________、找到对应的脱氧核苷酸序列。

科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶               分别对                 进行切割，切割后产生的DNA片段分别为               种、               种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有               作为标记基因。

（3）研究人员通常采用               法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用               技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的               过程。

为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。

(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制酶作用于图中的________处，DNA连接酶作用于______处。(填“a”或“b”)

(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有_______________。

(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用____________技术，该技术包括____________和________________。

家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力．将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。

（1）进行转基因操作前，需用            酶短时间处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。

（2）为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的      和      之间；若要检测干扰素基因在家蚕细胞中是否表达，可以采用的方法是                 。

（3）通过PCR技术可大量获取目的基因。PCR技术的原理是                 ，PCR反应体系主要包括：扩增缓冲液（含Mg²⁺）、水、能量、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、         和与干扰素基因特异性配对的DNA引物。

（4）培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制．通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以            ，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。

（5）“桑基鱼塘”生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要是遵循生态工程的            原理。同时，通过饲养家禽、家畜，栽培食用菌，提高农民经济收入，使保护环境和发展经济相互协调，这又体现了生态工程的         原理。