回答下列问题：

（1）博耶( H. Boyer)和科恩(S. Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____(答出两点即可)。

（2）体外重组的质粒可通过Ca²⁺参与的_______方法导入大肠杆菌细胞：而体外重组的噬菌体DNA通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________。

（3）真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加______的抑制剂。

生物技术已经渗入到了我们生活的方方面面，例如：

（1）目前临床用的胰岛素生效较慢，科学家将胰岛素B链的第28和29个氨基酸调换顺序，成功获得了速效胰岛素。生产速效胰岛素，需要对___________（胰岛素/胰岛素mRNA/胰岛素基因）进行定向改造，它属于第二代基因工程即________。将改造后的分子导入受体大肠杆菌，一般需要用_______处理大肠杆菌细胞，使之成为__________细胞。

（2）若某对夫妇结婚后发现妻子双侧输卵管堵塞，无奈需进行试管婴儿技术，该技术包括_______________________。（写出两项即可）

（3）连年种植单一品种造成病虫害增加主要违反了____________原理。各种粪便作为沼气发酵的原料，这体现了生态工程的_________________原理。

（1）过程①中将修饰后的CHS基因与Ti质粒连接成重组Ti质粒的酶称为               。这种酶主要有两类，一类是从T4噬菌体中分离得到的，另一类是从大肠杆菌中分离得到的。这两类酶都能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的                 键。

（2）图中将修饰后的CHS基因导入苦荞体细胞的方法称为                   ，除此外还可以利用的方法有                    。对过程②操作前，需先用Ca²⁺处理农杆菌，使其成为             细胞。

（3）检测转基因苦荞培育是否成功，可以比较转基因苦荞与普通苦荞的

                 含量或测定细胞中CHS含量进行鉴定。

科研人员从一些荒漠植物中成功克隆抗旱功能基因培育出抗旱耐盐碱和耐贫瘠能力明显的转基因紫花苜蓿新品系，它的研究成功对改良与利用大面积盐荒地、改善生态环境以及促进农牧业可持续发展具有现实意义。结合所学知识回答下列问题：

（1） 题目中的“克隆”最常用的是指_________技术，其原理为______________________。

（2）基因表达载体构建时目的基因的两端必须有______________________。

（3）紫花苜蓿为双子叶植物，常用的导入目的基因的方法是_______________。

（4）采用__________技术检测转基因植物的__________上是否插入了目的基因，同时还要采用__________技术检测目的基因是否在转基因植物细胞中表达。若进行个体水平的检测，需将该植株栽培于_________________________环境中，以观察其生长状况。

科学家利用PCR技术分别从抗根结线虫的番茄和辣椒中克隆抗性基因SIMi及CaMi，并利用遗传转化方法将它们转入对根结线虫敏感的番茄中，获得抗根结线虫的番茄转基因株系应用于植物抗根结线虫育种。请回答相关问题：

(1)PCR技术是扩增目的基因的常用手段。扩增过程中，目的基因DNA________后解旋为单链，__________与单链相应互补序列结合，在酶的作用下进行延伸。

(2)________________是实施基因工程的核心。

(3)将目的基因转入对根结线虫敏感的番茄中，最常用的方法是____________。通过转化，目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____________________。

(4)为了检测对根结线虫敏感的番茄中是否插入目的基因，可采用______________技术。检测目的基因在分子层面是否表达则可以用___________________的方法。

(5)为了比较两种抗性基因(SIMi和CaMi)在转基因后的抗根结线虫的效果，可分别取等量的两种成功表达的转基因番茄植株____________，比较其抗虫效果。

Ⅰ.下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点  的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对长度）。请回答下列问题：

（2）该基因来自__________________（填“基因组文库”或“cDNA文库”）。

（3）翻译时与密码子发生碱基互补配对的是__________上的反密码子。

2017年8月2日，中华人民共和国农业部官网发布《2017年农业转基因生物安全证书（进口）批准清单》包含耐除草剂大豆MON87705、耐除草剂油菜T45、耐除草剂玉米T25等10多个转基因生物系列，回答下列问题：

（1）耐除草剂玉米T25植株的培育用到了基因工程技术，该过程以耐除草剂基因作为_________(填“目的基因”或“标记基因”）。

（2）如果将耐除草剂基因插入到Ti质粒的________上，通过农杆菌的转化作用，可使该基因转移进入玉米细胞，并将其插入到玉米细胞中染色体的DNA上，这种将耐除草剂基因导入玉米细胞的方法叫做_____。

（3）基因表达载体构建时，需用到__________酶将耐除草剂基因和Ti质粒结合在一起，在基因表达载体中位于耐除草剂基因的首端和尾端分别具有_________和_________(填结构名称)，以启动和停止基因的转录。

（4）在耐除草剂玉米T25植株的培育过程中__________(填“能”或“不能”）用动物病毒作为耐除草剂基因导入玉米细胞的载体，原因是__________________。

预防乙肝最有效的途径是接种疫苗。将乙肝表面抗原基因转移到植物细胞内可生产乙肝疫苗。回答下列问题。

    (1)欲在短时间内大量扩增乙肝表面抗原基因，可利用___________________(填写中文名称)技术，其原理是______________。利用该技术扩增乙肝表面抗原基因的前提是______________。

    (2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，此外采用________________法十分简便经济。用抗原一抗体杂交技术检测植物细胞是否成功合成乙肝表面抗原蛋白。若有__________出现，表明目的基因已控制合成蛋白质产品。

    (3)将乙肝表面抗原基因导入植物细胞后，采用______________技术获得愈伤组织，该技术需在_____________条件下进行。

    (4)乙肝疫苗在2～8℃条件下保存，其不宜在常温下保存最可能的原因是_____________________。

(1) 制作固定化酵母细胞时，使用了图甲中方法〔  〕________（填出标号及名称），在该实验中，完全溶化的海藻酸钠溶液必须________ 后再与酵母细胞混合。充分混合均匀的酵母菌—海藻酸钠胶液可在饱和________溶液中形成凝胶珠。

 (2) 图乙表示________的实验过程, 通过B所示步骤得到滤液后，再向滤液中加入2moL/L的NaCl溶液的目的是________,C所示步骤加入蒸馏水的目的是________。