[生物—选修3：现代生物科技专题]

下图是转基因猕猴培育过程示意图，请据图回答：

（1）获取绿色荧光蛋白基因的方法包括________、利用PCR技术扩增目的基因和用化学方法直接人工合成等。基因工程的核心步骤是________（用图中数字表示），②过程常用的方法是________。

（2）PCR技术扩增目的基因的原理为________。扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列设计并合成________。

（3）图中过程⑦称为________，所用的早期胚胎通常是发育至________期的胚胎，受体雌猴对移入子宫的外来胚胎不会发生________反应，这为胚胎在受体雌猴内的存活提供了可能。

科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对干扰素基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图。

请回答：

（1）步骤①中，卵母细胞应培养到    期。

（2）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其    分离出ES细胞。ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上，表现为    ；在功能上，具有    。

（3）步骤③中，需要构建含有干扰素基因的基因表达载体。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有    等。由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，故构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从下图A、B、C、D四种单链DNA片段中选取     作为引物。用下图所示的质粒作运载体时，对干扰素基因片段和质粒进行酶切，可选用限制酶的组合为    或   。

【加试题】回答下列（一）（二）小题

（一）随着社会的发展，石油产品的使用越来越多，石油烃污染也越来越严重。为了筛选出分解石油烃能力强的微生物，人们不断地进行研究。下图为获取能分离出分解石油烃的微生物的土壤样品后的研究过程，请回答有关问题：

（1）获取土壤样品的取样地点最好选在  。为了能有效地分离出分解石油烃的微生物，过程①④所用的选择培养基只能以石油烃作为唯一碳源,其原因是  。

（2）根据⑤平板上生长的菌落，对④进行接种采用的方法是  ，若发现在⑤中无法区分菌落，可以将图中③取出的菌液    。

（3）纯化菌株时,通常使用的划线工具是  。采用  方法对其进行灭菌。划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,第二划线区域所划的第一条线上无菌落,其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是  （写出一点即可）。

（二）毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程如图。

（2）在过程②中，用  酶处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，叫细胞克隆。未经克隆化的细胞系具有  性。由于人们对动物细胞所需营养物质还没有完全搞清楚，因此在培养细胞时需在培养基中加入一定量的  ，在培养过程中应将培养瓶置于  培养。

（3）若要获得多只相同的转基因山羊，可对图中早期胚胎进行  后进行胚胎移植。

（4）下列有关转基因山羊培育过程的叙述，错误的是  。

A.图中重组细胞的细胞核来自导入目的基因的细胞

B.重组细胞最初分裂时开始进行DNA复制和基因的转录

C.将早期胚胎（如早期囊胚）植入到代孕母羊的输卵管或子宫角部位

D.如果KIFⅡ基因的序列是已知的，则可用化学方法合成或用聚合酶链式反应扩增该基因

(1)步骤①核移植前为获得更多的卵母细胞，采用________处理使其超数排卵，从输卵管中冲出的卵子处于________时期，去除卵母细胞的________(结构)。

(2)培养细胞过程中，要置于CO₂培养箱中，其中CO₂的主要作用是________。

(3)图中ES细胞来自________时期的________细胞。步骤③中需要先利用PCR技术扩增正常基因片段，可以根据正常基因的________设计引物，PCR技术中使用的酶为________。为检测目的基因是否表达，采用的方法为________。

资料甲：科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”；

科学家用农杆菌转化法培育出了转基因烟草。  

资料乙：T4溶菌酶在温度较高时容易失去活性。科学家用对编码T4溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。

资料丙：兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家将兔甲的受精卵发育成的胚胎移植到兔乙体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎可以在不同个体的体内发育。回答下列问题：

（1）资料甲属于基因工程范畴，将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用的__________ 法。构建基因表达载体常用的工具酶是_____________ 和________________ 。在培养有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是                   。

（2）资料乙中的技术属于_______ 工程的范畴，该工程是以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对__________________ 进行改造，或制造一种__________________ 的技术。 

（3）资料丙属于胚胎工程范畴。胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到          种的、生理状态相同的另一个雌性个体内，使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实例中，兔甲称为 ________体，兔乙称为___________ 体。