基因工程制药是制药行业突起的一支新军，自重组人胰岛素投放市场以来，利用转基因的工程菌生产的药物已有60多种。据此回答下列问题：

(1)制造工程菌所需要的工具酶是_________________________________________，其作用部位是________键。

(2)除采用人工合成目的基因的方法外，还可以通过____________和____________的方法获得目的基因，后者可以在特定的仪器中加入模板DNA、dNTP(即dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、________以及________等物质后自动完成。

(3)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，________(填“可以”或“不可以”)用大肠杆菌直接生产人的糖蛋白，原因是大肠杆菌缺少____________等细胞器。

回答下列有关基因工程、细胞工程的问题：

（1）基因工程自20世纪70年代兴起后，飞速发展，目前已经成为生物科学核心技术，在农牧业、工业、环境和医药卫生等方面展示出美好的前景。

①植物基因工程：主要用于提高农作物的________以及改良农作物的品质和利用植物生产药物。

②动物基因工程：可以用转基因动物生产药物，科学家将药用蛋白基因与________等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵中，进而培育出转基因动物，在其进入泌乳期后，通过分泌的乳汁获得所需药品，称之为________。

③医药卫生方面：可以利用基因工程生产药物，还可以治疗疾病。治疗遗传病最有效的手段是________。

（2）随着生物科技的进步，植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，已经普遍应用于社会生产的方方面面。

①微型繁殖：植物组织培养技术不仅可以保持优良品种的________，还可以高效快速实现种苗的快速繁殖，选取植物________（部位）进行组织培养可获得脱毒植株，实现作物增产。

②作物新品种的培育：常规育种培育出一个可以稳定遗传的农作物优良品种，一般需要经过5～6年的连续筛选，而________可极大地缩短育种年限；在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于________状态，因此容易产生突变。

③神奇的人工种子：人工种子就是以植物组织培养得到的________（至少答两种）等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子，人工种子在适宜条件下同样能够萌发长成幼苗。

回答有关基因工程的问题：

（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生粘性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_________（相同，不同）粘性末端的限制酶。

（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_________________________________。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入：为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为_______________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成______________，常用抗原-抗体杂交技术。

（3）如果要将某目的基因通过农杆菌传话法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_____________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________________上。

科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶               分别对                 进行切割，切割后产生的DNA片段分别为               种、               种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有               作为标记基因。

（3）研究人员通常采用               法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用               技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的               过程。

科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶的切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp^r为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶             对含鱼抗冻蛋白基因的DNA进行切割，切割后产生的DNA片段有      种，用限制酶             对质粒进行切割，切割后产生的DNA片段有      种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有                作为标记基因。

（3）研究人员通常采用           法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的            和            过程。

将几丁质酶基因导入棉花细胞中,可获得抗真菌的转基因棉,其过程如下图所示(注:农杆菌中Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中)。

(1)图中基因工程的基本过程可以概括为“四步曲”，其中的核心步骤是__________________。

(2)构建重组Ti质粒用到的工具酶是___________________。 

(3)该几丁质酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码几丁质酶的基因进行了改造，使其表达的几丁质酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了其耐热性。资料中的技术属于                 工程范畴，其基本途径是从预期蛋白质的功能出发，通过           和人工合成的方法获得该基因，再经表达、纯化获得蛋白质。

(4)检验转基因棉的抗菌性状，常用方法是___________________________。

(5)除了图中所示的将目的基因导入受体细胞的方法，还可用_______________或____________方法。

(6)棉花细胞经③④⑤得到试管苗，依据的理论基础是______________________。

下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：

（1）在基因工程中，A→B为       技术。利用的原理是_______，其中a为受热变性(解旋)的过程，其中b过程使用的酶是___________  。

（2）B→C为转基因绵羊的培育过程，c过程用到的生物技术主要有动物细胞培养和__________________技术。在动物细胞培养过程中，需让培养液中含有一定量的CO₂，其主要作用是  _________________________     。

（3）B→D为抗虫棉的培育过程，其中d过程常用的方法是  _______        。要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作。请写出在个体水平上的鉴定过程       _ _______   _____ _______      。

为培育具有优良性状的农作物、家畜和家禽，我国育种工作者发现并应用了多种育种方法。请联系所学知识回答：

（1）若采用杂交育种，所依据的遗传学原理发生在______________时期。一般来说，该育种方法是从_____________代开始挑选，然后连续自交获得符合要求的优良品种；但有时不需要连续自交即可获得，其原因是_________________。

（2）杂交育种只能利用已有基因进行重组，诱变育种方法可以弥补这一缺陷。但是该育种需要处理大量实验材料，其原因是基因突变具有_____、_______、________和有害性三个特点。

（3）近年来，基因工程也广泛用于育种工作中，其明显的优势是______________。上述育种方法中获得优良品种最简便的方法是______________。