回答下列（一）、（二）小题。

(一）某研究小组欲用苹果汁为原料，利用发酵瓶制作果酒和果醋，请分析回答：

(1)将苹果汁放入发酵瓶，要预留约________的空间。为得到酒精和糖含量较高的果酒，可在果汁中加入一定比例的______。若发酵瓶内持续无气泡产生，则需加入更多的_______，使发酵作用尽快发生。

(2)变酸的果酒表面有一层醋杆菌形成的菌膜，若要在该菌膜中筛选高表达量的醋杆菌菌株，可通过获得_______的方法来分离筛选。若要统计获得菌种的数目，则常采用_________法。对获得的优质醋杆菌菌种常用划线法接种在固体培养基______上低温保存。

(3)下图是果酒和果醋的发酵装置，关于果醋发酵叙述错误的是_______

A.发酵前，瓶内酒—冰混合物的pH需调至7.0

B.发酵过程中，充气口要适时适量充气

C.发酵过程中，排气口排出醋酸发酵产生的CO₂

D.发酵完成后，出料口的pH值不再减少

 (二）请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。

(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时，利用一定的物质，如生物诱  导剂_____作介导，使经免疫的小鼠脾细胞与________细胞融合，筛选出融合的细胞再进行细胞的______培养，获得纯系细胞，同时还要进行________检验，以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。

(2)有关杂交瘤细胞体外培养的叙述，正确的是________

A.用固体培养基培养          B.用滋养层细胞支持生长

C.能进行传代培养            D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物

(3)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体，科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导人到受体细胞，该技术的核心步骤是______________,噬菌体是这些关键基因的___________。

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

(1)完成过程①需要加入缓冲液、原料、_______和引物等,过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是_____________。

(2)过程③和⑤中，限制酶XhoI切割DNA,使__________键断开，用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是_________。

(3)构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子的作用是__________，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有____________等结构(至少写出两个结构)。 

(4)过程⑥中,要用CaCl₂预先处理大肠杆菌,使其处于容易吸收外界DNA的_______的细胞。

(5)利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因,目的是_______________。

（6）_______________________，是检测目的基因是否发挥功能第一步。

下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请根据图回答。

（1）能否利用人的皮肤细胞来完成Ⅰ过程？        。为什么？                 。

（2）若图中B物质共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则Ⅳ、Ⅴ过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶               个。

（3）B与C经切割产生相同的              ，再加入适量的              ，才可形成D。

（4）为使过程Ⅷ更易进行，可用                         （药剂）处理E。

（10分）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________________和________________。

(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：

菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答：

（注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）

（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是_        __，此外还可用                 作为载体。

（2）下图限制酶M和N切割产生的黏性末端是__ ____ ____ __，连接它们所需要的基本工具是__              ________。

（3）为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用__  _____处理，使其处于感受态。

（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及___________和  ________ 的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。

（5）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据抗虫基因（目的基因）两端的部分碱基序列设计特异引物，若其中一种引物共用了31个，则目的基因最多扩增了__  __次。

（6）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如下表所示。

请据表回答：

①对照组应饲喂等量的__                ________                __。

②据表分析，__               ____            __差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

(1)“剪切”所使用的酶是______________，“剪切”结果使DNA分子片段产生了________。携带“β胡萝卜素合成基因”进行转化的载体具有一个至多个___________，以供外源基因插入。

(2)在“黄金水稻”的培育中，能确定“β胡萝卜素合成基因”已成功在水稻体内表达的简 便方法是____________。

下图是利用转基因技术生产干扰素的简化流程。请分析回答：

(1)过程①使用的限制性核酸内切酶能使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的                      （化学键）断开。运载体的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过             原则结合。

(2）过程②是                ,它也是基因工程的核心。图中A上除了目的基因外,还必须有启动子、终止子和          。启动子是RNA聚合酶             的部位,以驱动干扰素基因转录。为直接检测干扰素基因是否转录，可从细胞中提取          与用放射性同位素标记的____________作探针进行分子杂交

(3) 利用PCR扩增仪大量扩增目的基因的前提是目的基因的核苷酸序列要有一段是已知的,以便根据这一序列合成引物，除了该物质和目的基因外,扩增仪中还需加入四种脱氧核苷酸和           酶，并适时调整温度，才能使目的基因数量成指数式扩增。