下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

R－7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA，可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3′－UTR)结合，进而影响基因的表达。为研究R－7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达，科研人员将基因B中对应3′－UTR的DNA片段与荧光素酶基因(R－7不影响荧光素酶基因的表达)重组后导入家蚕胚胎细胞观察其表达结果。请回答：

(1)利用PCR技术扩增基因B对应3′－UTR的DNA片段，应先依据该基因的一段核苷酸序 列合成______________________。

(2)利用_____________________________________酶可将上述DNA片段插入荧光素酶基因表达载体(如图)上的位点_____________，构建重组载体。

(3)将重组载体与R－7共同导入家蚕胚胎细胞，同时应设置两个对照组，即将_____________________、_____________________分别导入两组家蚕胚胎细胞。

(4)科研人员分别从实验组和对照组细胞中提取________________，经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下，荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并发出荧光)，其结果如图。

(4)依据实验结果可推断，R－7影响基因B的表达，即通过遵循______原则，R－7与基因B所转录的mRNA的3′－uTR结合，进而__________(填"促进"或"抑制")基因B的表达。

(1)完成过程①需要加入缓冲液、原料、_______和引物等,过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是_____________。

(2)过程③和⑤中，限制酶XhoI切割DNA,使__________键断开，用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是_________。

(3)构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子的作用是__________，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有____________等结构(至少写出两个结构)。 

(4)过程⑥中,要用CaCl₂预先处理大肠杆菌,使其处于容易吸收外界DNA的_______的细胞。

(5)利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因,目的是_______________。

（6）_______________________，是检测目的基因是否发挥功能第一步。

（1）②为PCR过程，除了要加入引物、原料外还需要加入________________________，在此过程中引物的作用是_____________________________________。

（2）BamHⅠ的识别序列为—G↓GATTC—，HindⅢ的识别序列为—A↓AGCTT—，选用这两种酶进行操作的意义是______________________________，除此之外，③过程还需要_____________酶。

（3）BLG基因5′端调控序列能使hLF基因在羊的乳腺细胞中特异性表达，这是因为__________________________________________________________________。

（4）要获得能表达目的基因的羊，应将重组质粒导入羊的_____________（填“乳腺细胞”“去核卵细胞”或“受精卵”），获得优良胚胎后，为了提高胚胎的利用率，常采用____________的方法来处理胚胎。

图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_____连接。

​(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是_____末端，所断开的化学键叫____键。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有____种不同长度的DNA片段。
(4)为了提高试验成功率，需要通过___技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝。
(5)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_____。在导入重组质粒后，为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌，需要用添加_____的培养基进行培养。

(6)目的基因D能“嫁接”到质粒上，其原因是_____（从DNA分子水平分析），在选出的大肠杆菌内基因D能成功表达的原因是_____。

绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV 蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是具有重要经济价值的双子叶植物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV 的烟草，主要流程如下图所示。

(1)理论上，基因组文库与cDNA文库中含的基因区别是______________。

(2)科学家从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中①过程表示_______。

(3)④过程将重组Ti质粒导入烟草体细胞的常用方法是_______。

(4)过程⑥可采取_______的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过_______的方法来确定植株是否具有抗性。

随着科学技术的发展，人们可以通过结合多种现代生物技术大量生产出人类需求量大的一些药物，如我国基因工程药物的研制和生产就已取得极大的成功。目前科学家已在牛和羊等动物的乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品，大致过程如图所示：

（1）哺乳动物的体外受精主要包括[a]____________、[b]___________和受精等几个主要步骤。若要充分发挥优良母畜的繁殖潜能，可给供体注射___________，使其排出更多的卵子。 

（2）在过程c中需要用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶，构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是_______________识别、结合位点。  

（3）d过程常用的方法是____________，e过程的名称为_________，胚胎移植的实质是:早期胚胎在相同生理环境条件下______________的转移。 

（4）若要一次获得多只完全相同的转基因牛，应采用胚胎分割技术，通常选择发育良好、形态正常的_________或桑椹胚。

(3)若希望该转基因水稻生产的“金色大米”含维生素A含量更高、效果更好，则需要通过________工程手段对合成维生素A的相关目的基因进行设计。

下图是利用奶牛乳汁生产人类血清白蛋白的图解，根据下图回答：

(1)在基因工程中，在②进入③之前要用_______________等工具来构建基因表达载体,基因的表达载体成分除了启动子之外还有_____________,将构建好的表达载体导入③的常用方法是__________________。

(2)从③到④的过程中一般利用未受精的去核卵细胞为受体，而不用普通的体细胞，原因是_________________。

(3)④到⑤的过程中正确的操作方法____，把⑤送入⑥的最佳时期是___________。

(4)⑦是⑥生出的后代，那么⑦的遗传性状和_______________最相似，要实现⑦批量生产血清白蛋白，则要求③的性染色体是_____。

(5)可以从哺乳动物的______________________中分离出来ES或EK细胞。这类细胞的形态特征有_______________________。