人组织纤溶酶原激活物(htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得。流程如下：

（1）htPA基因与载体构建重组表达载体需要用到的工具酶有__________。基因表达载体中除了要有目的基因以外，还要有启动子，它是_________识别和结合点部位；除上述外还需有_____________________。检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用____________技术。

（2）为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素使其超数排卵，采集的卵子必须发育到________(时期)；采集的精子需要经过________处理，才具备受精能力。

（3）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是__________。生产上常用________期的胚胎进行移植；为了获得母羊，移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行___________。利用______________技术可获得多个转基因个体，这体现了早期胚胎细胞的全能性。

（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到__________，说明目的基因成功表达。

（1）在基因工程中，A→B为_____________技术，利用的原理是_______________。其中①为________过程，冷却至55℃将a________结合到互补链上，②过程由热稳定DNA聚合酶催化从a起始合成子链。

（2）⑤过程是基因表达载体的构建，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有____________________以及标记基因等。

（3）抗虫基因导入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称______。目的基因导入植物细胞的方法除上图所示以外，还包括_________和_________。检测目的基因能否在棉株体内稳定存在方法是_________________。如要检查棉株是否最终获得抗虫性状，则需要在________水平上进行检测。

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

R－7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA，可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3′－UTR)结合，进而影响基因的表达。为研究R－7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达，科研人员将基因B中对应3′－UTR的DNA片段与荧光素酶基因(R－7不影响荧光素酶基因的表达)重组后导入家蚕胚胎细胞观察其表达结果。请回答：

(1)利用PCR技术扩增基因B对应3′－UTR的DNA片段，应先依据该基因的一段核苷酸序 列合成______________________。

(2)利用_____________________________________酶可将上述DNA片段插入荧光素酶基因表达载体(如图)上的位点_____________，构建重组载体。

(3)将重组载体与R－7共同导入家蚕胚胎细胞，同时应设置两个对照组，即将_____________________、_____________________分别导入两组家蚕胚胎细胞。

(4)科研人员分别从实验组和对照组细胞中提取________________，经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下，荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并发出荧光)，其结果如图。

(4)依据实验结果可推断，R－7影响基因B的表达，即通过遵循______原则，R－7与基因B所转录的mRNA的3′－uTR结合，进而__________(填"促进"或"抑制")基因B的表达。

应用生物工程技术获得人们需要的生物新品种或新产品。请据图回答下列问题。

(1)要使人的生长激素基因在牛的垂体细胞中特异性表达,完整的基因表达载体要包括目的基因、_________、__________________、标记基因等部分.在③之前要检测早期胚胎细胞是否已经导入人生长激素基因,宜采用_________________技术.③过程培养到桑椹胚或囊胚阶段,可以采用______           _____技术,培育出多头相同的转基因牛犊。

(2)prG能激发细胞不断分裂,通过基因工程导入该调控基因来制备单克隆抗体,Ⅰ最可能是___________细胞,Ⅱ代表的细胞具有____              ________的特点.

(3)在抗虫棉培育过程中，④过程中的受体细胞如果采用愈伤组织细胞，则与采用叶肉细胞相比较，其优点是_______________________________，⑤过程采用的技术是___________________________。科学家预言，此种“转基因抗虫棉”独立种植若干代以后，将出现不抗虫的植株，此现象来源于_______________。

内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，它有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用．研究发现内皮素功能异常与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系．内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体结合而发挥生物学效应．ET_A是内皮素的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实现ET_A基因在细胞中高效表达，为后期ET_A的体外研究以及拮抗剂的筛选、活性评价等奠定基础．其过程如下（图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为C^↓CCGGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C^↓TCGAG）．请分析回答：

（1）完成过程①需要的酶是　　；与过程②相比，过程①特有的碱基配对方式是　　．

（2）过程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA，使　　键断开，形成目的基因的黏性末端是　　．用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是　　．

（3）过程⑥中，要用　　预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界DNA的感受态．

（4）利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因，目的是　　．

（5）人皮肤黑色素细胞上有内皮素的特异受体，内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后，会刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而使黑色素急剧增加．美容时可以利用注射ET_A达到美白祛斑效果，这是因为ET_A能与内皮素结合，减少了内皮素与　　的结合，抑制了内皮素对黑色素细胞的增殖和黑色素的形成．

下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请根据图回答。

（1）能否利用人的皮肤细胞来完成Ⅰ过程？        。为什么？                 。

（2）若图中B物质共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则Ⅳ、Ⅴ过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶               个。

（3）B与C经切割产生相同的              ，再加入适量的              ，才可形成D。

（4）为使过程Ⅷ更易进行，可用                         （药剂）处理E。

禽流感病毒H7N9是一种RNA病毒， 下图是利用现代生物技术制备H7N9病毒单克隆抗体的流程，请据图回答问题。

（1）①过程表示_____________，③过程用到的工具酶是______________。

（2）构建基因表达载体时，目的基因的首端必须含有_____________，它的作用是与_____________结合，从分子水平上鉴定目的基因是否转录可采用____________技术。

下面是蛋白质工程的基本途径，试回答下列有关问题：

（3）图中③过程的主要依据是每种氨基酸都有其对应的            。通过③过程获得的脱氧核苷酸序列不是完整的基因，要使这一序列能够表达、发挥作用，还必须在序列上、下游加上启动子和                  。

（4）植物体细胞杂交技术，利用的主要原理有                                ，化学法一般是用          作为诱导剂来诱导细胞融合。组织培养时，细胞先经过       过程，才能再分化成各种组织。

(1)“剪切”所使用的酶是______________，“剪切”结果使DNA分子片段产生了________。携带“β胡萝卜素合成基因”进行转化的载体具有一个至多个___________，以供外源基因插入。

(2)在“黄金水稻”的培育中，能确定“β胡萝卜素合成基因”已成功在水稻体内表达的简 便方法是____________。

在生命科学的研究中，基因重组已经不仅是研究的目的，而且日益成为一项重要的研究手段，所以有着不可替代的地位。如图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答：

(1)基因工程中，获取目的基因的主要途径包括直接分离法和______________。

(2)步骤①和②中常用的工具酶是_____________和_____________。

(3)图中质粒上有抗青霉素V钾和抗红霉素两个标记基因，认真观察经过步骤①和②后，有些质粒上的____  _______基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。

(4)为了促进步骤③的进行，一般要用_________________处理大肠杆菌。

(5)步骤④中，将锥形瓶内的大肠杆菌接种到含红霉素的培养基A上培养，目的是筛选含_________________________的大肠杆菌，能在A中生长的大肠杆菌有_______种。

(6)步骤⑤中，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含青霉素V钾和红霉素)和C(含红霉素)两个培养基上，一段时间后，在培养基________(B、C)上会出现含目的基因的菌落。