下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

假设A、b代表玉米的优良基因，这两种基因是自由组合的。现有AABB、aabb两个品种，为培育出优良品种AAbb，可采用的方法如图所示：

（1）由①→⑤→⑥的育种方法的原理是_________，该育种方法的优点是_________。

（2）由①→②→③的育种方法虽然育种时间长，但是可以将多种优良性状集中在一个生物体身上，③步骤具体的操作方法是__________________。

（3）⑦育种方法往往不一定能达到目标，原因是__________________________。

（4）④过程必需要用到的一种特异性的工具酶是_____________________。

回答下列（一）、（二）小题：

（一）天津独流老醋历史悠久、独具风味，其生产工艺流程如下图。

（1）在糖化阶段添加酶制剂需要控制反应温度，这是因为酶         。

（2）在酒精发酵阶段，发酵罐先通气，后密闭。通气能提高        的数量，有利于密闭时获得更多的酒精产物。若在酒精发酵环节中温度过低，带来的弊端是           。

（3）在醋酸发酵阶段，独流老醋采用独特的分层固体发酵法，发酵30天。工艺如图2：

①发酵过程中，定期取样测定醋酸杆菌密度变化，趋势如图3。据图2、3分析，与颠倒前相比，B层醋酸杆菌在颠倒后密度变化的特点是         ，由此推测，影响醋酸杆菌密度变化的主要环境因素是        （至少答出两项）。

②乳酸含量高是独流老醋风味独特的重要成因。发酵过程中，发酵缸中         （答出什么时期的什么层）的醋醅有利于乳酸菌繁殖，积累乳酸。

③成熟醋醅中乳酸菌的种类、数量均明显减少，主要原因可能是        。

（二）如图为纯种荷斯坦小奶牛的繁殖过程，请据图回答下列问题。

（1）克隆动物培育过程与图示繁殖过程相比，特有的技术手段是       ，动物的这两种繁殖类型，实质性的区别在于后者仍是        。

（2）对供体母牛做超数排卵处理时，一般可采用         激素。

（3）如果要培育能产生某种药用蛋白的转基因荷斯坦奶牛，可采用具体的          技术将目的基因导入到受精卵中，并采用“         ”杂交的方法检测受体细胞中的目的基因是否表达。

（4）在转基因技术中，常需要对相关DNA的碱基序列进行测序。下图中甲、乙为DNA测序仪显示的图像，已知甲图显示的碱基顺序为TCGAAT，则乙图显示的碱基顺序为（   ）

A.TCGCAC        B.ACCGTG        C.ATTCAG        D.TCCGGA

如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线．图中tet^R表示四环素抗性基因，amp^R表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindⅢ、SmaI直线所示为三种限制酶的酶切位点．据图回答：

（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________（限制酶）同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含__________的培养基上进行。
（2）过程②代表的生物技术是__________，此技术对供体母牛、代孕牛进行选择后，并用激素进行的处理是_____________。如对囊胚阶段的胚胎进行切割，应注意____________________，以免影响胚胎的恢复和进一步发育。
（3）若转基因牛的乳汁中不含人乳铁蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是_______________________________。

基因工程、细胞工程、胚胎工程和生态工程技术飞速发展，在生产中获得了越来越广泛的应用。请回答下列相关方面的问题：

（1）胰岛素是治疗糖尿病的有效药，天然胰岛素注射后会堆积在皮下，需较长时间才能进入血液，科学家利用__________________技术对胰岛素进行改造使其成为速效药，提高了胰岛素的治疗效果；人类遗传病是很难用一般药物进行治疗的，治疗遗传病的最有效的手段是__________________。

（2）植物组织培养技术不仅可以保持优良品种的________________，还可以髙效快速实现种苗的大量繁殖，选取植物____________（部位）进行组织培养可获得脱毒植株，实现作物增产。

（3）哺乳动物的受精过程中，精子顶体内的顶体酶能协助精子穿过卵细胞的________________________________________最终进入卵细胞内完成受精作用，防止多精子入卵受精的两道屏障是____________________________。

（4）桑基鱼塘生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要遵循了生态工程__________________的原理；我国西北土地沙化严重，其中一个重要原因是过度放牧，导致草场退化，这主要违背了生态工程中的____________________的原理。

科学家用转基因克隆技术将人的岩藻糖转移酶基因植入牛的基因组内，使其在牛奶中含有岩藻糖抗原。这种转基因牛奶可作为口服药，用来防治各种胃病，具有重要的医学价值和经济社会价值。转基因克隆牛的过程示意如下。

（1）上述流程图中用到的生物工程技术除基因工程外，还用到的技术有_____________、_____________、____________、___________________。

 (2)在岩藻糖转移酶的cDNA融合基因的首端需加上牛乳蛋白启动子序列，目的是______。

（3）在细胞核移植时通常选用_____________________时期卵母细胞作受体细胞。这个时期的卵母细胞可在母牛的_______________中直接获得。核移植成功后，用物理或化学方法激活受体细胞，目的是________________。

(4)重组细胞在发育培养液中培养，培养液成分除无机盐、有机盐、维生素、激素等营养物质外，还需特别添加________等物质，形成的早期胚胎一般要发育到______________阶段才进行移植，胚胎移植成功与否的关键是________。

下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。

据图回答：

(1)(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在______酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_____的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的____________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的_____________序列，再通过化学方法合成所需基因。

(2)利用PCR技术扩增基因A时，需要在反应体系中添加的有机物质有_____、______、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为__________________________。

(4)在基因工程中，常用Ca²⁺处理D，其目的是________________________________________。

（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割。为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶______________分别对_______进行切割，切割后产生的DNA片段分别为_____种。

（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有________________作为标记基因。

（3）研究人员通常采用_________________法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。通常采用________________技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质。

（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株。图中③、④依次表示组织培养过程中番茄组织细胞

的________过程。

基因工程是在现代生物学、化学和工程学基础上建立和发展起来的，并有赖于微生物学理论和技术的发展运用，现在基因工程在动植物育种上有广泛而重要的应用。基因工程基本操作流程如图所示，请据图分析回答：

（1）图中A是________，最常用的是________；在基因工程中，需要在___________________酶的作用下才能完成剪接过程。

（2）不同种生物之间的基因移植成功，从分子水平上分析，进行基因工程的主要理论依据是__________________________也说明了生物共用一套____________。

（3）研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源是______________。

（4）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明_________________。如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子中______（填“一定”或“不一定”）含有抗病基因。

材料一：为获得纯合高蔓抗病番茄植株，采用的方法如图1所示。请据图回答

（1）杂交育种方法是通过[①]___________将____________集中在一起，再通过[②]__________筛选出符合要求的稳定遗传个体。

（2）图中③需用秋水仙素处理_________，可快速获得纯合高蔓抗病番茄植株。

（3）将某杂草中的抗病基因（T）导入蕃茄叶肉细胞，获得的品种与原品种_____（填“属于”或“不属于”）同一物种。

（4）科研人员挑选出成功导入基因T的抗性番茄植株，其整合情况可能如图2所示（不考虑其他变异情况），请设计实验方案，确定导入基因T的位置和数量。

①实验方案：_______________________________________________________。

②实验结果及结论：

I．若________________________________，则如图甲所示；

II．若子代全部抗病，则如图乙所示；

III．若_______________________________，则如图丙所示。

材料二：若家蝇的长翅（A）对残翅（a）为显性，长肢（B）对短肢（b）为显性，且种群足够大，在随机交配后，表现型比例为长翅长肢63%，长翅短肢21%，残翅长肢12%，残翅短肢为4%，则基因型为AaBb和aaBb的个体所占的比例分别为________、________。