在基因工程中，为了获得目的基因，一般有三种方法：

(1)通过        获得目的基因。这一方法是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，分别导入受体菌中，储存起来而获得的。

(2)           技术。这一方法模仿了DNA复制原理，根据已知目的基因的脱氧核苷酸序列，合成一对含大约20个碱基的引物，引物本身确定了从DNA的哪个位置开始复制，这样，就可以利用含目的基因的DNA长链，复制出大量的目的基因（短链）出来。在复制时，需要周期性地调节反应系统的温度，在大约90-95⁰C时，DNA双链       (互补结合或解旋分离)，这一步        (需要或不需要)解旋酶；降温后，引物与单链DNA的特定序列结合，以         为原料，合成子链，从5^，端到3^，端延伸，延伸的过程中，需要            (填某物质)，此物质能耐95⁰C的高温而不被破坏。

(3)             方法。此方法一般用于基因较小，且核苷酸序列已知的情况下。

重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变（如图）。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物（如图的引物b和引物c），然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物（如图的突变产物AD）。请回答下列问题：

（1）PCR与体内DNA复制相比，不需要                酶参与。

（2）引物中（G+C）的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性                   。

（3）图中获得产物AB和CD，必须将引物a、引物b和引物c、引物d置于不同反应系统中，这是因为                   。除图中所示外，在不同的反应体系中需要共同加入的物质是                 。 

（4）在引物a、引物b组成的反应系统和引物c、引物d组成的系统中均进行一次复制，共产生                 种双链DNA分子。

（5）图中获得产物AB，至少要经过                    轮循环，循环产物中含有引物a的DNA占有的比例为                         。

化学与科学、技术、社会、环境都密切相关，下列说法不正确的是

（1）短时间内大量扩增抗凝血酶Ⅲ蛋白基因经常采用                 技术。过程①是将抗凝血酶Ⅲ蛋白基因导入受精卵，该过程常用的方法是                 。            

（2）过程②包括             技术和               技术；为获得多只与该转基因奶牛遗传物质相同的牛犊，在过程②还可使用          技术。

（3）若要检测牛奶中是否含有抗凝血酶Ⅲ蛋白，可采用              技术。

（4）如果检测发现抗凝血酶Ⅲ蛋白基因被成功导入了受精卵，但却没有检测到抗凝血酶Ⅲ蛋白的存在，那应该考虑分别位于目的基因首端的          和末端的          没有设计好，应从这方面进一步改善。

据图回答下列问题：

（1）过程①所需的酶是           。过程②中PEG还可以用               等物理方法替代，全部过程用到的生物技术的原理是                         。

（2）过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的                存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。原生质体经过            再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。

（3）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和                 植株的根尖，通过解离、漂洗、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。

（4）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1—4进行PCR扩增的结果。据图判断，再生植株1—4中一定是杂种植株的有              。

限制酶1：——↓GATC——；                限制酶2：——CCGC↓GG——；

限制酶3：——G↓GATCC——

⑴主要步骤：

①制备两种培养基：一种是＿＿＿＿培养基，另一种＿＿＿＿＿的培养基。分别分成两份，依次标上A，A^／的B，B^／，备用。

②分别向A、B培养基中接种＿＿＿＿＿＿。

③接种后，放在恒温箱中培养3～4天。

④分别从A、B培养基的菌落中挑取生长良好的菌种，接种到A^／、B^／培养基中。

⑤接种后，把A^／、B^／培养基放入恒温箱中培养3～4天。

⑵回答问题：

在步骤①中，为保证无杂菌污染，实验中应采用的主要措施有＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

第④⑤两个步骤的目的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（2）用基因工程技术从经过分离、提纯的圆褐固氮菌中获取固氮基因，然后进行PCR扩增。下列表1和表2分别表示用PCR扩增固氮基因的反应体系及反应条件。

①从上表中可得出，PCR技术与DNA复制相比较，主要区别之一是                                                         。

     此外，从反应条件看，所使用的DNA聚合酶应具有__________的特点。每次循环都需要2种引物的主要原因是_______________           ________________。

②下图为第1轮循环产生的产物。请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物。

请回答：

（1）图中重组细胞的细胞核来自            细胞，早期胚胎移入受体子宫后继续发育，经桑椹胚、囊胚和             胚最终发育为克隆猪。

（2）在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl-2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl-2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl-2基因的转录水平。

①图中X表示                 过程。

②从基因组数据库中查询Bcl-2 mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成                用于PCR扩增，PCR扩增过程第一轮循环的模板是                    。