下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：

（1）代表蛋白质工程操作思路的过程是________；代表中心法则内容的是________。(填写数字)

（2）写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容：

③________________；④________________；⑤________________。

（3）蛋白质工程的目的是____________________________________________________，通过________________________实现。

科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图。

⑴ ①过程构建的A是________________________。它必须将目的基因与_______________等调控组件重组在一起，才能通过分泌乳汁来生产人凝血因子IX医用蛋白。

⑵ 在核移植之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，目的是________________________________________________________________。

⑶ 进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生__________________，这为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。

⑷ 采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得很多转基因绵羊，这是因为___________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________。

⑸ 蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_________________________________和____________

__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。

科学家将人的胰岛素基因与质粒重组后，导入牛的受精卵，并成功从牛奶中提取到了人胰岛素。请根据如下操作流程回答相关问题。（已知酶I的识别序列和切点是－G↓GATCC－ ，酶II的识别序列和切点是－↓GATC－）。

（1）目的基因可以从基因文库中直接获取，然后可以利用PCR技术扩增基因，PCR的原理是__________________，利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成 __________________。

（2）据图分析，在构建重组质粒的过程中，目的基因用 __________________ （填“酶I”或者“酶II”）进行了切割。检验重组载体导入能否成功需要利用 __________________ 作为标记基因。检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法是__________________。

（3）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是__________________。

（4）若希望通过转基因牛生产的胰岛素具有作用快、持续时间长等特点，则需要通过_______ 工程手段对人的胰岛素基因进行设计，该工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→__________________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1和图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：

(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。

(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。

(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________________________________________________________。

(4)与只使用EcoR Ⅰ相比较，使用BamH Ⅰ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_____________________________。

(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入___________酶。

(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________________。

(7)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_____   ___和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质。

(8)将重组DNA分子导入植物受体细胞的常用方法为               法。 为了确定转基因是否培育成功，要用放射性同位素标记的                         作探针进行分子杂交检测。

抗凝血酶Ⅲ蛋白是一种血浆糖蛋白，临床上主要用于血液性疾病的治疗。凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。下列是生产这两种酶的相关思路，请回答下列问题：

（1）图1为通过培育转基因奶牛获得抗凝血酶Ⅲ蛋白的流程。

①图中过程a指的是利用________法将目的基因导入受精卵，受体细胞不选用体细胞的理由是________________。

（2）从牛胃液中分离得到的凝乳酶以其催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。

①从牛胃细胞中提取目的基因。以此DNA为模板进行PCR扩增，还需要____________、____________、____________等。

②为提高重组DNA分子的比例，在构建重组DNA分子（如图2所示）时最好选用______________作限制酶。

③经研究发现，如果将该凝乳酶的第20位和24位氨基酸变为半胱氨酸，则其催化能力将提高2倍。现已知通过蛋白质工程可生产高效凝乳酶，请写出有关制备步骤：________________________。