回答下列问题：

（1）博耶( H. Boyer)和科恩(S. Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____(答出两点即可)。

（2）体外重组的质粒可通过Ca²⁺参与的_______方法导入大肠杆菌细胞：而体外重组的噬菌体DNA通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________。

（3）真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加______的抑制剂。

Ⅰ.下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点  的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对长度）。请回答下列问题：

（2）该基因来自__________________（填“基因组文库”或“cDNA文库”）。

（3）翻译时与密码子发生碱基互补配对的是__________上的反密码子。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)cDNA文库属于_____基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_____反转录产生的cDNA片段，与________连接后储存在一个受体菌群中。

(2)切割DNA分子的工具是_______________，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断开，形成黏性末端或平末端。

(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是________DNA连接酶。

(4)如果受体细胞是大肠杆菌，需要用________处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。

党的十九大报告指出要“大力度推进生态文明建设……全面节约资源有效推进，能源资源消耗强度大幅下降。重大生态保护和修复工程进展顺利，森林覆盖率持续提高。生态环境治理明显加强，环境状况得到改善”。请回答下列相关问题：

（1）生态工程是对________进行修复重建，对________进行改善，促进人和自然的和谐发展。

（2）全面节约资源有效推进，能源资源消耗强度大幅下降很大程度上得益于实行“________”的原则，从而实现废弃物的资源化。

（3）实行生态工程，很多时候还需要考虑人文关怀、贫困地区的收入等问题，才能很好的解决“前面造林，后面砍林”的现象，这遵循的是生态工程的________原理。

（4）在保护濒危植物方面，运用了很多技术，比如微型繁殖运用的是________技术，其原理是________。

（5）在处理城市生态系统垃圾时，采用了生物治理法，分解者处理垃圾的相关目的基因从分解者体内用酶切割下来，再与________相连导入受体菌。

图1 表示含有目的基因D 的DNA 片段长度(bp 即碱基对)和部分碱基序列,图2 表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamHⅠ、Mbo、Sma 4 种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为

C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题:

(1)图1 的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 脱氧核糖--_________--脱氧核糖 连接。

(2)若用限制酶Sma完全切割图1 中DNA 片段,产生的末端是 ______ _ 末端,其产物长度为__________________。

(3)若图1 中虚线方框内的碱基对被T-A 碱基对替换,那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1 及其对应的DNA 片段,用限制酶Sma 完全切割,产物中共有_____种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D 通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是 ________________。在导入重组质粒后,为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_________     的培养基进行培养。经检测,部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D 不能正确表达,其最可能的原因是 _____________________________________________。

农业科技工作者在烟草中找到了一抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育抗病棉花品系。请回答下列问题。

（1）为了能把该抗病基因转入到棉花细胞中，常用的载体是__________。

（2）要使载体与该抗病基因连接，首先应使用限制性内切酶（限制酶）进行切割。假如载体被切割后，得到的分子末端序列为，则能与该载体连接的抗病基因分子末端是（    ）

（3）切割完成后，采用DNA连接酶将载体与该抗病基因连接，连接后得到的DNA分子称为_____。

（4）再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去_________棉花细胞，利用植物细胞具有的_________性进行组织培养，从培养出的植株中筛选（选择）出抗病的棉花。

（5）转基因棉花获得的_______________是由该表达产物来体现的。

（1）打靶载体中含有的目的基因是     ，需将该目的基因和与细胞内靶基因同源的DNA片段都重组到质粒上，整合时用到的酶有      。

（2）图中的同源重组位点是指打靶载体和小鼠基因组DNA中具有     的DNA片段。

（3）将打靶载体线性化是选择的限制性核酸内切酶的识别序列不能位于    等中。线性化的打靶载体可采用    法导入小鼠细胞。将小鼠细胞培养在含     的培养液中，可以成功筛选出打靶成功的小鼠细胞，经细胞培养后可以获得大量的具有目的基因的细胞。

（4）可以通过动物细胞克隆技术获得含人胰岛素基因的小鼠，其过程是将打靶成功的小鼠细胞的细胞核移植到     中，培养到     期移植到代孕母鼠子宫内进行发育。

（2）体外重组的质粒可通过Ca²⁺参与的_______方法导入大肠杆菌细胞：而体外重组的噬菌体DNA通常需与_______组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是__________。

（3）某农业生态工程基地按照生态和经济规律，对种植业和养殖业进行了优化设计．通过套种、间种和轮种等技术的应用，增加农作物的种类，使种植的农作物为该生态系统组成成分中的消费者提供更多种类的食物。应用的生态学原理是___________________。

I.[生物一选修1:生物技术实践]

酵母菌是生物科学研穷中一种重要的生物材料，请回答：

（1）酵母菌的新陈代谢类型是__________，其细胞内将葡萄糖分解为酒精的酶存在于__________。

（2）某同学尝试用新鲜葡萄制作葡萄酒、为验证发酵液中含有酒精，取2mL发酵液加入试管中，滴加O.5mL浓硫酸酸化的重铬酸钾溶液并轻轻震荡，观察到溶液变__________色，则证明发酵液中含酒精。

（3）研究者利用基因工程技术改造酵母菌，得到如下四种变异菌株：①菌株Ⅰ——不能合成纤维素酶，菌株Ⅱ——合成的纤维素酶不能分泌到细胞外，菌株Ⅲ——合成的纤维素酶能分泌到细胞外，菌株Ⅳ——合成的纤维素酶分泌并固定于细胞壁。

在以纤维素为唯一碳源的培莽基上能生长繁殖形成菌落的是菌株_______，若在培养基中加入_______，则菌落周围会出现透明圈。在利用纤维素生产酒精时，与菌株Ⅲ相比，菌株Ⅳ的纤维素酶的利用率高，因为______________________________________________________________。

（4）为研究发酵罐中酿酒酵母菌的生长情况，常要取样统计分析，并测定pH值。若某研究人员将样品的次序搞乱了，那么判断取样顺序的主要依据基__________（填“酵母菌的数量”或“发酵液的pH”）。

II.[生物一选修3:现代生物科技专题]

内皮抑素是一种效果良好的新型抗癌药物，由胶原XⅤⅢ（广泛存在于肝脏等组织中）降解产生。我国科学家研制成含转入内皮抑素基因双歧杆菌的口服液，口服后，双歧杆菌在肠道定植、繁殖，双歧杆菌死亡裂解后，其产生的内皮抑素活性片段被吞噬、转运到肿瘤组织发挥作用。回答下列问题：

（1）要利用逆转录的方法合成人内皮抑素基因，应从__________组织细胞中提取mRNA，与细胞中内皮抑素基因相比，这种方法合成的cDNA没有__________、启动子、终止子等。

（2）根据内皮抑素基因的脱氧核苷酸序列设计并合成引物，利用__________技术得到大量内皮抑素基因。

（3）临床上也有通过静脉注射内皮抑素基因重组腺病毒，使肿瘤生长受到抑制。在进入临床使用前需要进行目的基因的检测与鉴定：用胰蛋白酶将血管内皮组织___________，制成细胞悬液→转入

含_____________________等天然成分的培养液中培养得到大量血管内皮细胞→用重组腺病毒感染血管内皮细胞，若抗原—抗体杂交检测呈阳性并观察到细胞凋亡，则说明_________________。

（4）口服含转入内皮抑素基因双歧杆菌口服液、静脉注射内皮抑素基因重组腺病毒，两种方法都能使肿瘤生长受到抑制，其中属于体内基因治疗的是__________（填“第一种”或“第二种”）。

某基因工程中如图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答：

（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由______________________连接．

（2）若用限制酶SmaI完全切割图1的DNA片段，产生的末端是___末端，其产物长度为___________________．

（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T﹣A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d．从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有___种不同长度的DNA片段．

（4）若将图2中质粒和基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______．在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_____的培养基进行培养．经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是____________________________________________．