【生物——选修1：生物技术实践】

从自然菌样中筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。

(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适宜的环境中采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。筛选噬盐菌的菌样应从____________环境中采集。

(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择_____________的培养基，并在__________条件下培养。

(3)如图甲、乙是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。

获得图甲效果的接种方法是________________，获得图乙效果的接种方法______________。

(4)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行____________，培养基的灭菌方法是________________。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在____________条件下进行。

利用微生物分解淀粉生产糖浆具广阔的应用前景。某同学为了从长期种植马铃薯的土壤中分离出能够高效分解淀粉的细菌，进行如下实验：

(1)实验步骤：

①配制以           为碳源的固体培养基，为了使培养基凝固成固体，应该向培养基中加入的物质是               。

②将土壤样品接种到已灭菌的培养基上，在恒温培养箱中培养一段时间后，培养基上出现        。

③将接种针用                   法灭菌后，从②中的培养基上挑取一定量细菌，接种入          （固体、液体）培养基，在恒温摇床上培养24h，使细菌大量繁殖。

④配制与①相同的培养基，并加入少量碘液，使培养基呈蓝紫色。用                  法将上一步大量繁殖后的细菌接种到已灭菌的培养基上。

⑤培养一段时间后，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现较大的          现象的菌落即为初选菌落，经进一步分离、纯化后即可达到实验目的。

(2)上述实验步骤中，从用途看，①所用培养基属于             培养基，⑤所用培养基属于             培养基。

（1）微生物的分布：微生物主要分布在富含                 的土壤表层；不同微生物对pH值的要求不同，细菌常生活在                 性的环境中。

（2）微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用                        和氯化汞进行消毒；在微生物培养中，对培养基常用                   方法进行灭菌。

（3）微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是               和             。

（4）微生物的计数：运用活菌计数法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是                                                              。

（5）微生物的鉴定：为筛选出纤维素分解菌，应向培养基中加入                染料，将呈           反应，再依据培养基中是否产生                   来筛选纤维素分解菌；为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的              （选择、鉴别）培养基中加入              指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变红色。

A．[生物技术实践]

淀粉分解菌是能分解淀粉的一类微生物，在自然条件下，淀粉分解菌和其他各种细菌混杂生活在土壤中。某实验小组利用培养基将土壤中的淀粉分解菌筛选出来，回答下列问题：

(1)将土壤中的淀粉分解菌筛选出来的培养基应添加________作为唯一的碳源，此外还需要添加的成分有___________________。

(2)稀释涂布平板法可用于微生物的接种和计数，该实验小组将样液分别稀释了10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍，然后将10²倍、10³倍、10⁴倍的稀释液分别涂布在不同的平板上，涂布多个稀释倍数的稀释液的目的是____________________________________。若有三个平板均涂布了稀释倍数为10³倍的稀释液1mL，分别形成了68、70和72个菌落，则原样液体中每毫升含有淀粉分解菌________个，该方法测量值一般比实际值________。

(3)涂布一段时间后，待长出菌落后可向培养基中滴入________，挑取有明显淀粉分解圈的单菌落，一般来说，淀粉分解圈越大，则淀粉分解菌分解淀粉的能力越________。

B．[现代生物科技专题]

科学家从某细菌中提取抗冻基因，转入番茄并培育出抗冻番茄。下图是转抗冻基因番茄的培育过程，含抗冻基因的DNA片段和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。分析回答问题：

​

(1)若要获得抗冻基因，可以从细菌中提取；也可以通过分析抗冻蛋白________的序列推测基因的结构，进而人工合成抗冻基因。对获得的抗冻基因可用________技术进行扩增。

(2)上述两种途径获得的抗冻基因________(填“是”或“否”)一定相同，原因是_____________________________________________。

(3)用图中的质粒和抗冻基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ酶切割，原因是________。图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用________酶对外源DNA、质粒进行切割。

(4)图中过程⑤表示______________________________________。

 牛奶中富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质，但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。国家标准是每毫升牛奶中细菌数小于30000个。以下是牛奶消毒及细菌检测实验。

（1）图中步骤①称为          消毒法。步骤②是                 。

（2）培养基中的蛋白胨可以为微生物提供        。进行步骤③操作时，应选用下列中的哪种工具进行涂布？                 。为了避免杂菌污染，此步骤应在          附近进行。

（3）将接种后的培养基和作为对照的      同时放入37℃恒温培养箱中，培养36小时。取出后统计各平扳的菌落数，结果如上表所示。应该选择其中稀释倍数为               的平板进行计数，经过消毒后的5ml牛奶中，细菌数大约是           个。

（1）进行①过程的目的是            ；②过程所使用的接种方法是             。用该接种方法对微生物进行计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目             ，原因是                                  。

（2）从用途上来说，Ⅰ号培养基属于        培养基，制备该培养基的步骤是：计算→称量→溶化→       →         。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备Ⅰ号培养基外，还要提供       的条件。此培养条件也是        （填“果醋”或“果酒”）制作过程中需要的。

（3）在接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是    。

（4）以尿素为唯一氮源的培养基培养“目的菌”后，加入             指示剂后变红色，说明“目的菌”能分解尿素。理由是                                     。

（5）为进一步确定取自瘤胃中液体的适当稀释倍数，将接种的培养皿放置在37℃恒温培养箱中培养24h-48h，观察并统计具有红色环带的菌落数，结果如下表，其中          倍的稀释比较合适。假设每个平板分别接入0.1mL稀释液，据此可得出每毫升瘤胃液体中的活菌数为               个。

一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。

(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有1 L土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释至10³倍。各取0.1 mL已稀释10³倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液样品中菌体数为________。

(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养基的特点是___________________________。

(3)接种技术的核心是___________________________。接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步____________________________，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是________________________或有氧条件抑制了这些细菌的生长。

(4)在培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的氮源主要是________，有透明圈菌落利用的氮源主要是________，据此可筛选出目的菌。实验结果如下图所示，A～E五种菌株中，________是最理想菌株。

螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：

→→→→

(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有脲酶，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现          色环带。

(2)步骤X表示          。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即          和          。接种时所用的接种环通过          灭菌，在第二次及其后的划线操作时，总是从          开始划线。

   (3)在培养时，需将培养皿倒置并放在          中。

(4)临床上用¹⁴C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将¹⁴C标记的____________分解为NH₃和¹⁴CO₂。

[生物——选修1：生物技术实践]

下表为培养某种微生物的培养基配方，请回答有关问题：

 （1）该种培养基可用来培养            的细菌。从用途看，这种培养基称为___ ____培养基。

（2）如果要通过统计培养基中的菌落数来估算样品中的细菌数，则在上述培养基中还需要添加 

        作为凝固剂，接种时应采用                  法才能达到目的。这种方法统计到的是样品中_______的数目，除了这种方法，还有                也是测定微生物数量的常用方法。在用不同浓度的稀释液培养得到的平板中，为保证统计的数目结果较为准确，一般选择菌落数在_______的平板进行计数。

（3）某同学从土壤中分离出目的细菌以后，若要对其作进一步的鉴定，可在上述的培养基中加入_______指示剂，培养该菌后，如果指示剂变_______，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，在无氧条件下，发酵能将葡萄糖转换成多种有机酸并生成二氧化碳，某研究机构用“滤膜法”对受污染的河流水体进行了大肠杆菌活菌数目的测定。

回答下列相关问题：

（1）研究人员向葡萄糖蛋白胨培养液中加入适量的溴麝香草酚蓝水溶液后，装入图甲所示的试管中，再将污水水样滴加进去振荡均匀，适宜条件下培养一段时间后可观察到溶液颜色的变化是                    。

（2）图乙中滤膜的孔径应______（“大于”、“小于”或“等于”）大肠杆菌。

（3）制备图乙中牛肉膏蛋白胨固体培养基时，培养基的灭菌方法是          ，待培养基冷却至   ℃左右时进行倒平板。

（4）为了鉴别大肠杆菌菌落，可向培养基中加入                染料，该研究机构通过统计______色菌落的数目，计算出单位体积样品中大肠杆菌数目。理论上他们的统计值要比实际值          ，（“偏高”、“偏低”或“相等”） 理由是                                                          。