铁皮石斛是一种名贵中药材，有生津养胃、降血糖和增强免疫力等作用，有效成分为石斛多糖、石斛碱等，温州雁荡山素有“中国铁皮石斛之乡”的美誉。请回答下列问题：

（1）用茎快速繁殖铁皮石斛时，给茎消毒时无须使用的是__________ （填“乙醇”，“无菌水”，“甘露醇”或“次氯酸钠”）。在细胞分裂素相对较多和生长素相对较少的培养基中培养茎的切段，待长出较多的_____________ ，将其进行______________ （处理）后再转入__________培养基中继续培养，直至长成幼苗，之后再后将苗移至草炭土或蛭石中进行___________，再转移至土中定植。

（2）研究发现，铁皮石斛的生长发育与其体内的内生菌密切相关。为进一步研究内生菌的作用，需要大量的内生菌进行相关实验。分离内生菌时采用的最简便的方法是________ 。

A．G6玻璃砂漏斗过滤法              B．血细胞计数法

C．划线分离法                       D．涂布分离法

    再将纯化的内生菌转移到液体培养基中进行_____________ 。

（3）研究发现，质量浓度为200mg /L的卡那霉素能有效抑制铁皮石斛细胞的增殖与分化。科学家欲利用卡那霉素，采用农杆菌转化法对现有铁皮石斛品种进行基因改良。在基因工程操作中，对于要导入受体细胞的_____________ 应同时带有目的基因和_____________ 基因，这样才能利用含有卡那霉素的培养基将成功导入目的基因的受体细胞筛选出来。

（4）鉴定铁皮石斛的品质，可通过苯酚—浓硫酸法测定石斛多糖的含量。其原理是石斛多糖水解成单糖并脱水生成糖醛衍生物后，与苯酚缩合产生橙黄色化合物，在490nm处测定光密度值，以不同浓度的葡萄糖溶液为标准溶液建立标准曲线，便可知道样品中石斛多糖的含量。

（5）为高效提取石斛多糖，可在提取液中加入_____________ ，以提高铁皮石斛的出汁率。

乳头瘤病毒(HPV)持续感染可导致宫颈癌发生。科研人员将HPV外壳L1蛋白基因与在人体中不能复制但能有效表达外源基因的痘苗病毒重组，制备新型疫苗。

(1)用痘苗病毒感染鸡胚细胞，一段时间后洗去吸附的病毒，将鸡胚细胞转入液体培养基中培养，培养基中加入适量抗生素以避免________。在培养基中加入L1蛋白基因与质粒连接构建重组质粒，使L1蛋白基因与________在鸡胚细胞内发生DNA重组，得到重组病毒疫苗。依据L1蛋白基因序列设计引物扩增重组病毒DNA，以检测_______________________。

(2)为研究重组疫苗的保护作用，将生长发育状况一致的小鼠随机均分为三组，1组注射用PBS缓冲液配制的重组病毒疫苗100 μL,2组注射________作为对照，3组注射________作为空白对照。

(3)给上述三组小鼠皮下注射C3细胞(含有HPV基因的癌细胞)，观察、记录小鼠成瘤情况，结果如下。

据实验结果分析，尽管各组小鼠都可成瘤，但实验组小鼠__________________________，说明重组病毒疫苗具有一定的免疫保护作用。接种重组病毒疫苗的小鼠体内表达________作为抗原，刺激机体产生特异性免疫。皮下注射C3细胞时，HPV引起________细胞迅速增殖、分化，产生大量抗体，从而起到免疫保护作用。根据免疫学知识，注射疫苗后，只有诱发出机体的________免疫，才能有效清除癌细胞。

(4)若欲检验重组病毒疫苗是否有治疗作用，对小鼠进行的处理最恰当的是________(选填下列字母)。

A．先注射HPV病毒，一段时间后注射重组病毒疫苗

B．先注射重组病毒疫苗，一段时间后再注射HPV病毒

C．先注射C3细胞，一段时间后注射重组病毒疫苗

D．先注射重组病毒疫苗，一段时间后再注射C3细胞

含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题

（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是从                生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是                （填“基因组文库”,“cDNA文库”或“基因组文库”和“cDNA文库”）

（2）含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有①                ；②                。

（3）利用PCR扩增目的的基因的过程由高温变性（90~95°C）,低温复性（55~60°C），适温延伸（70~75°C）三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在                °C处理后仍然具备催化活性。

（4）在PCR扩增目的基因时，为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记，反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的                （填“腺嘌呤核糖核苷酸”，“dATP”或“ATP”）.

兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力，请回答：

（1）从兔肝细胞中提取mRNA，在_________________酶的作用下形成互补DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成_____________，再导入用氯化钙处理的_________，侵染矮牵牛叶片。将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是______（A.叶片在含适宜浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽  C.再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上生根    D.愈伤组织在含适宜浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株）。

（2）取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适宜浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于___________上，进行液体悬浮培养液。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是___________________________，从而使叶片保持正常的形态。

白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有雌激素样作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。下图表示利用植物组织培养的方法生产白藜芦醇的过程。请分析作答：

外植体愈伤组织丛芽或根—→完整植株

(1)植物组织培养是在____________和人工控制条件下，将________的植物体器官、组织、细胞，在人工配置的培养基上培养成完整植株，利用的原理是______________________________________。

(2)植物组织培养的核心步骤为____________和____________。①和②过程需要的培养基的激素含量________(填“相同”或“不同”)。

 (3)利用细胞产物工厂化生产技术提取白藜芦醇需要将外植体培养至________，原因是此阶段的细胞分裂能力强，但白藜芦醇的产量一般较低，可以用______________________处理愈伤组织，再筛选产量提高的细胞进一步培养。

(4)将白藜芦醇的基因转入大豆等重要粮食作物和经济作物中，提高农作物的营养价值和品质。导入受体细胞时常用方法为_____________________，目的基因是否插入的检测方法为_____________________。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）cDNA文库属于     基因文库,其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的       通过反转录产生cDNA片段,与        连接后储存在一个受体菌群中.

（2）切割DNA分子的工具是           ，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的            断开，形成黏性末端或平末端。

（3）基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是       DNA连接酶。

（4）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是           ；如果受体细胞是大肠杆菌,需要用          处理细胞,使之成为感受态细胞,才能吸收DNA分子.

科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因（能控制合成MPT64蛋白）成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题：

（1）为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在               的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与结核杆菌中该基因碱基序列             (填“相同”或“不同”)。

（2）通常采用           扩增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成               ，在操作步骤中需要加热至90-95℃的目的是                   。

（3）根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到              上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞。要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有                。

（4）研究发现，如果将MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，其保存时间将大大延长，科学家可以生产上述耐储存的MPT64蛋白的现代生物工程技术是                   。

下图表示科学家采用不同方法培育良种牛的过程, a~h为操作过程,请据图回答有关问题:

(1)“试管牛”技术的操作流程是 (填字母)。

(2)d操作的名称是________,受体子宫内胚胎发育的过程中,细胞不断分裂,其分裂方式为________ 。

(3)图中所示的过程中用到的激素是________,其目的是获得更多的卵母细胞,经受精后可得到早期胚胎;图中早期胚胎属于胚胎发育的________阶段,其中胚胎干细胞来源于________(填数字标号)。

(4)过程h常用的方法是________。

我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：

（1）为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的_______________（复制原点、启动子、标记基因）。

（2）水稻的转化过程为：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过________过程，培养出________________________，然后用______________________法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，最后诱导形成水稻植株。

（3）为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有mRNA并反转录成______________________，再以反转录产物为模板，进行基因扩增。若以根细胞为材料扩增结果为阳性（有产物生成），以叶细胞为材料扩增结果为阴性（无产物生成），则说明_______________________________________________________________

（4）将生长至4叶期的转基因幼苗转入____________________溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察现象，若___________________则说明转基因植株获得了耐盐特性。

请回答下列有关转基因抗病毒马铃薯的问题：

  （1）获取抗病毒基因常用的方法有______________________、_____________________________________、__________________________________。

  （2）获得转基因马铃薯的核心操作是_______________________________________，其中与调节抗病毒基因转录有关的部分是_______。

  （3）利用农杆菌转化法将抗病毒基因导入马铃薯，首先应将重组质粒导入_________，再将它与切成小圆片的马铃薯叶片共同培养，使插入在Ti质粒上的______________中的抗病毒基因可以转移至受体细胞，并整合到马铃薯的_________________________。

  （4）将共同培养后的马铃薯转移到特定的培养基上，在___________________________（填激素名称）的协同调控作用下，经过脱分化形成_________________，再分化得到胚状体或丛芽；对获得的植株进行个体生物学水平鉴定的做法是__________________________。