含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题：

（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是从_________生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是____________________。（填字母A:基因组文库、B:cDNA文库、C:基因组文库和cDNA文库）。

（2）含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA，其原因可能有①______________；②___________。

（3）利用PCR技术扩增目的基因的过程由高温变性（90~95℃）、低温复性（55~60℃）、适温延伸（70~75℃）三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在____________℃处理后仍然具备催化活性。

（4）在PCR扩增目的基因时，为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记，反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的____________(填"腺嘌呤核糖核苷酸"、"dATP"或"ATP")。

根据国际糖尿病联盟报告，在最近的10年中，全世界糖尿病的发生率呈逐年增长的趋势。糖尿病是由多种因素引起的代谢紊乱疾病，已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后威胁人类健康和生命安全的第三位重大疾病。

(1)核移植的受体细胞一般选用_____细胞。进行相关显微操作时，一般用微型吸管一并吸出细胞核和_____。

(2)细胞在体外培养时，除培养液提供必需的营养条件、适宜的温度和pH、气体环境外，还需要有无菌、无毒环境，为保证无菌、无毒环境，在培养液中通常要加入_____。此外，还应定期_____，以便清除代谢废物。

(3)现有一段人工合成的正常胰岛素基因的脱氧核苷酸序列，可利用PCR技术扩增正常胰岛素基因，该技术的原理是_____。

(4)定向诱导的本质是使重组细胞发生_____________。

科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因（能控制合成MPT64蛋白）成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。回答下列问题：

（1）为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在___________的作用下合成双链cDNA片段，该cDNA片段_________(填“含有”或“不含有”)终止子。

（2）通常采用PCR技术扩增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，原因是_________________，在操作步骤中需要加热至90～95℃的目的是__________。

（3） 构建基因表达载体时，根据农杆菌的特点，常将MPT64基因插入Ti质粒的　______，原因是___________________________________________。

（4）基因表达载体导入胡萝卜细胞后，要通过植物组织培养技术培育出幼苗，该技术在进行再分化时，除必要的营养供应和激素调节外，还必须给光照，原因是_____________________。该技术要求无菌操作，其目的是________________________________________。

（5） 要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有______。

（6）科学家探知，若能把MPT64蛋白第20位和第24位的氨基酸都改变为半胱氨酸，可以更好保证所生产的肺结核疫苗分子的稳定性。该实例的操作_________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是__________________________________________________________。

资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，如下图所示，在很短的时间内，在试管中将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：

（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的_____键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过______酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循__________________________________。

（2）PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，是依据什么原理？______________________。

（3）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。

 ①第1组：_____________________； ②第2组_____________________：  。

（4）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用¹⁵N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以¹⁴N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含¹⁵N标记的DNA分子单链数占全部DNA总数的比例为_______________________。

（5）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（  ）

A．白细胞DNA B．病毒蛋白质 　

C．血浆抗体  　  D．病毒核酸

以下是有关现代生物科技的两个问题，请回答:

I.下面是与动物细胞工程有关的问题，请分析回答：

（1）在进行动物细胞培养时，首先要将动物组织剪碎，然后用_______________处理，以使其分散成单个细胞，制成细胞悬液。

（2）气体环境中CO₂的作用是______________________________。

（3）应用于核移植的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞，原因是10代以后细胞可能发生_________________________________。       

II. 转基因抗病香蕉的培育过程如下图所示，图中PstI、SmaI、EcoRI，ApaI等为限制质粒和抗病基因上的箭头表示限制酶的切割位点。下图表示四种限制酶的识别序列及酶切点。

（1）若要获得抗病基因，能否用限制酶SmaI对图中对应的位点进行切割？_____________。要获得含抗病基因的重组质粒能否用PstI、ApaI限制酶切割质粒？________________。

（2）卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，根据这一原理可以利用含卡那霉素的培养基筛选已导入重组质粒的香叛細胞。由此推断重组质粒中应含有___________________基因，作为标记基因。

（3）②、③阶段是否可使用同种培养基?_____________。

斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具体纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验：

（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，将重组质粒显微注射到斑马鱼_________中，整合到染色体上的G基因_________后，使胚胎发出绿色荧光。

（2）根据上述杂交实验推测

（3）杂交后，出现红·绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代_________（填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中__________发生了交换，导致染色体上的基因重组。

（5）我国西北一些地区年降雨量较少，适宜种植灌木和草，却被硬性规定种植属于乔木的杨树，致使许多地方的杨树长成半死不活状，结果防护林成为残败的“灰色长城”．其失败的原因主要是违背了 ______ 原理．

用已学基因工程相关知识，解决以下问题：

A：下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。

(1)  若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是

—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶_______________切割质粒，用限制酶_______________ 切割抗虫基因。①过程在___________(填“体内”或“体外”)进行。

B：多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶使细胞壁破损。成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如下图。据图回答下列问题：

(1)若已获取PG的mRNA，可通过____________方法获取PG基因。PCR技术扩增目的基因的前提是_______________，以便根据这一序列合成引物。

(2)该质粒含14000碱基对（14kb），若同时使用BamHⅠ和Smal两种限制酶切割，产生的片段有5kb、7．5kb、1．5kb,则只用限制酶BamHⅠ切割时产生的片段长度分别是_____和______。