[生物——选修1：生物技术实践]

根据所学知识，回答下列问题

（1）用萃取法提取胡萝卜素的原因是________。萃取的效率主要取决于萃取剂的________，同时还受原料颗粒的大小、含水量等条件的影响；在对新鲜胡萝卜进行干燥时，要注意控制________，否则会引起胡萝卜素的分解。

（2）从橘皮中能提取出橘皮油，为提高出油率，需要将橘皮干燥，并用________浸泡。为探究浸泡时间对出油率的影响，应设置________作为对照。

（3）酒精发酵时，当酒精含量达到12～16％时，发酵就停止了。为获得耐酒精的酵母菌，用涂布器在含高浓度酒精的培养基上进行________操作。这种培养基只允许耐酒精的微生物生长，该培养基称作________培养基。再根据菌落的________、隆起程度和颜色等菌落特征获得酵母菌。

微生物强化采油(MEOR)是利用某些微生物能降解石油，增大石油的乳化度，降低石油黏度的原理，通过向油井中注入含微生物的水来提高采油率的新技术。以下是人们筛选、纯化和扩大培养该类微生物的实验操作。请回答下列问题：

(1)土壤是微生物的大本营，该类微生物应取自___________________________的土壤。

(3)接种后，应密封培养的原因是________________，培养一段时间后在培养基上形成降油圈，此时选取___________就可获得高效菌株。

(4)扩大培养过程中需要对微生物进行计数。取0.2mL样品，用固体培养基对其培养，最后统计三个平板，菌落数分别是200、180、220。则样品中微生物的数量为____________个／mL。该统计结果_________(填“低于”或“高于”)实际值。

乳酸菌是一种厌氧型细菌，实验室常利用溶钙圈法对乳酸菌进行筛选，其原理是乳酸菌产生的酸性物质和CaCO₃反应而出现溶解圈，以下为乳酸菌筛选的步骤：

①制备乳酸菌筛选培养基（MRS培养基）（成分：蛋白胨、牛肉膏、无机盐、葡萄糖和水）

②调节pH，并将MRS培养基和CaCO₃溶液灭菌后混合，倒平板制备培养基。

③梯度稀释样品，选择合适的稀释倍数接种。

④挑选产生溶钙圈的菌落。

请回答下列问题：

（1）乳酸菌常用于制作泡菜，用于制作泡菜的泡菜坛要在坛盖边沿的水槽中注满水，其目的是___________，制作过程中亚硝酸盐含量的变化是______。

（2）MRS培养基中蛋白胨可以作为乳酸菌的____________，CaCO₃一方面可以用于鉴别乳酸菌，另一方面还可以________。对培养基一般采用________________法灭菌。

（3）乳酸菌筛选过程中所用的接种方法是_________。若要进一步纯化乳酸菌，可以采取的措施是________________。

常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，科学家欲从果园的葡萄上或土壤中分离这种酵母菌。操作如下：

(1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是______________________________________。获得纯净培养物的关键是____________________。

(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是__________________________。划线的某个平板经培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是______________________________。

(3)将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后将瓶中的液体用涂布器涂布接种于以木糖为唯一________的固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间，获得能利用木糖的多个酵母菌__________。实验中所用培养基按功能属于__________培养基。

(4)若要检测土样中的酵母菌含量，应采用__________________法。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________________。然后，将1 mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，各在3个平板上分别接入每种稀释度的稀释液0.1 mL，经适当培养后，6个平板上的菌落个数分别为59、57、58、2、7和5，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数为____________个。

工业生产中，提取天然β—胡萝卜素的方法之一：利用红酵母等微生物进行发酵，经过菌体裂解、离心后进行萃取。回答以下有关问题：

(1)若要初步确定某一菌株是否为红酵母菌株，相对简便的操作是通过_________法将菌种接种于固体培养基上，并在适宜的条件下培养一段时间，观察其形成的菌落的_____________(填2个)特征。

(2)碳源的种类对β胡萝卜素的产量有着一定的影响，有关研究结果如下：

据表分析，最佳碳源是_________。若要进一步探究最佳氮源，请简要写出实验设计思路：____________________________________________________。

(3)有科研人员尝试利用紫外线处理红酵母，以获得高产菌株。对处理所得菌株分别进行培养并经裂解、离心后，根据β—胡萝卜素_____________________的特点，可以采用有机溶剂萃取法萃取产物，并对萃取产物通过_______________法进行鉴定，鉴定过程需要用_____________样品进行对比。经定量分析后，若得到高产菌株，要对其进行长期保存，可采用__________的方法在—20℃的冷冻箱中保存。

苹果干腐病是一种名为茶藤子葡萄座腔菌的真菌引起的疾病，病菌通常由枝条伤口入侵感染，在伤口处形成溃疡。某中学的科研小组计划分离出该真菌，并进行药物防治实验，为苹果干腐病的防治提供合理的建议。经过查阅资料，确定了分离时所用的PDA培养基配方，如下表所示：

    该真菌在上述PDA培养基上生长时有特定的形态特征：辐射状白色匍匐菌丝，绒毛状。

    (1)要获得菌落，则上表中还应添加的成分是________。氯霉素的作用是______________。培养基的制备步骤包括计算、称量、溶化、________、倒平板。等平板冷却凝固后，将平板______________，以防止冷凝水污染培养基。

    (2)用剪刀从染病枝条溃疡处剪取1×1 cm²的患病组织，并用0.1％的升汞进行消毒，置于培养基中心，在合适条件下进行培养，共培养五组。待菌落形态特征稳定后，用______________法将该致病菌分别转移至含有等量0.5％苦水碱剂、40％福美砷、清水的上述PDA培养基中进行抗药性实验，并每隔24 h记录一次最后划线区域的菌落数目。

    ①选取______________的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致的菌落数目遗漏。

    ②记录结果如下：

    从结果分析可知，_______________能很好地抑制该真菌的生长，适合用于防治苹果干腐病。

在微生物连续培养时，一部分旧的液体培养基以一定的速度流出，同时不断有等量的新鲜液体培养基流入以保证微生物对营养物质的需求。研究人员将大肠杆菌JA122菌株接种到葡萄糖含量受到限制的液体培养基中，连续培养多代，然后取样分析其中存在的新菌株。请回答下列问题：

    （1）液体培养基中除了把葡萄糖作为____________外，还应该含有________________________。

    （2）样品中还发现了CV101、CV103新品种，对其菌株的代谢差异进行分析发现，CV103对葡萄糖吸收率最高，代谢终产物是醋酸盐。进一步研究表明，CV101可以在过滤的培养过CV103的培养基中生长，据此作出的推测是：_______________。请设计并完成下列实验，来验证你的观点。

    ①配制______________________的固体培养基（A组）和不含碳源的固体培养基（B组）；

    ②将等量且适量稀释的CV101菌液分别接种到A、B培养基中培养一段时间，并观察记录菌株的生长情况。实验过程应在____________条件下进行。

    ③预期实验结果：___________________________________________________________。

    （1）配制的细菌培养基除了含有水、碳源、氮源和无机盐等主要营养成分外，还应加入适量的____________和琼脂。在培养基各成分溶化与灭菌之间，要进行的操作是__________。

    （2）接种微生物的方法有很多，图1中过程①②③所示的方法为___________________。用该方法统计样本菌落数后，所得数据需要乘10ⁿ后，才可表示乳酸菌的数量（单位：个/mL），这里的n＝________________。用该方法统计样本菌落数时，同时需要做A、B、C三个培养皿，原因是_______________________。

    （3）为了检测乳酸菌对抗生素的敏感性，取该单菌落适当稀释，接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。将分别含有A、B、C三种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含抗生素A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A___________（填“敏感”或“不敏感”）；含抗生素C滤纸片周围的透明圈比含抗生素A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是____________。

幽门螺杆菌感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下，请回答：

    （1）幽门螺杆菌能够以尿素为唯一氮源，是因为含有_______，培养基中加入酚红指示剂，若有幽门螺杆菌，则菌落周围会出现_________环带。

    （2）上述培养过程中，能够“浓缩”幽门螺杆菌的步骤是____________________。

    （3）采用稀释涂布平板法，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌，其原因是__________________________________________。

    （4）上述实验结果统计的菌落数，_________（填“是”或“不是”）原患者样品中含有的幽门螺杆菌活菌数。

常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。

（1）将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后将瓶中的液体用________法接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养，获得各种菌落。

（2）将培养基上的酵母菌菌株转接到________的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。从存活的酵母菌中提取DNA，经大量扩增获得目的基因。

（3）将目的基因连接到质粒上，该质粒具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因。将重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏________能力的酿酒酵母作为受体菌。

（4）将上述获得的转基因酿酒酵母接种在以_________和_________为碳源的培养基中进行发酵能力测试。随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能_________，即说明所需菌株培育成功。