科研人员从一些荒漠植物中成功克隆抗旱功能基因培育出抗旱耐盐碱和耐贫瘠能力明显的转基因紫花苜蓿新品系，它的研究成功对改良与利用大面积盐荒地、改善生态环境以及促进农牧业可持续发展具有现实意义。结合所学知识回答下列问题：

（1） 题目中的“克隆”最常用的是指_________技术，其原理为______________________。

（2）基因表达载体构建时目的基因的两端必须有______________________。

（3）紫花苜蓿为双子叶植物，常用的导入目的基因的方法是_______________。

（4）采用__________技术检测转基因植物的__________上是否插入了目的基因，同时还要采用__________技术检测目的基因是否在转基因植物细胞中表达。若进行个体水平的检测，需将该植株栽培于_________________________环境中，以观察其生长状况。

科学家利用PCR技术分别从抗根结线虫的番茄和辣椒中克隆抗性基因SIMi及CaMi，并利用遗传转化方法将它们转入对根结线虫敏感的番茄中，获得抗根结线虫的番茄转基因株系应用于植物抗根结线虫育种。请回答相关问题：

(1)PCR技术是扩增目的基因的常用手段。扩增过程中，目的基因DNA________后解旋为单链，__________与单链相应互补序列结合，在酶的作用下进行延伸。

(2)________________是实施基因工程的核心。

(3)将目的基因转入对根结线虫敏感的番茄中，最常用的方法是____________。通过转化，目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_____________________。

(4)为了检测对根结线虫敏感的番茄中是否插入目的基因，可采用______________技术。检测目的基因在分子层面是否表达则可以用___________________的方法。

(5)为了比较两种抗性基因(SIMi和CaMi)在转基因后的抗根结线虫的效果，可分别取等量的两种成功表达的转基因番茄植株____________，比较其抗虫效果。

Ⅰ.下图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图。复制原点是质粒能正常复制的必需组成。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。EcoRⅠ、PvuⅠ为相应的限制酶切割位点，括号内的数据是该切点与复制原点  的距离，单位为kb（1kb = 1000个碱基对长度）。请回答下列问题：

（2）该基因来自__________________（填“基因组文库”或“cDNA文库”）。

（3）翻译时与密码子发生碱基互补配对的是__________上的反密码子。

2017年8月2日，中华人民共和国农业部官网发布《2017年农业转基因生物安全证书（进口）批准清单》包含耐除草剂大豆MON87705、耐除草剂油菜T45、耐除草剂玉米T25等10多个转基因生物系列，回答下列问题：

（1）耐除草剂玉米T25植株的培育用到了基因工程技术，该过程以耐除草剂基因作为_________(填“目的基因”或“标记基因”）。

（2）如果将耐除草剂基因插入到Ti质粒的________上，通过农杆菌的转化作用，可使该基因转移进入玉米细胞，并将其插入到玉米细胞中染色体的DNA上，这种将耐除草剂基因导入玉米细胞的方法叫做_____。

（3）基因表达载体构建时，需用到__________酶将耐除草剂基因和Ti质粒结合在一起，在基因表达载体中位于耐除草剂基因的首端和尾端分别具有_________和_________(填结构名称)，以启动和停止基因的转录。

（4）在耐除草剂玉米T25植株的培育过程中__________(填“能”或“不能”）用动物病毒作为耐除草剂基因导入玉米细胞的载体，原因是__________________。

预防乙肝最有效的途径是接种疫苗。将乙肝表面抗原基因转移到植物细胞内可生产乙肝疫苗。回答下列问题。

    (1)欲在短时间内大量扩增乙肝表面抗原基因，可利用___________________(填写中文名称)技术，其原理是______________。利用该技术扩增乙肝表面抗原基因的前提是______________。

    (2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，此外采用________________法十分简便经济。用抗原一抗体杂交技术检测植物细胞是否成功合成乙肝表面抗原蛋白。若有__________出现，表明目的基因已控制合成蛋白质产品。

    (3)将乙肝表面抗原基因导入植物细胞后，采用______________技术获得愈伤组织，该技术需在_____________条件下进行。

    (4)乙肝疫苗在2～8℃条件下保存，其不宜在常温下保存最可能的原因是_____________________。

2015年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获奖。工业上青蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路。科学家先通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现该高产植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是___________________，需要的条件有___________________________________________。

（2）如果用青蒿某个时期mRNA反转录产生的双链cDNA片段，该双链与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做青蒿的________________。

（3）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答：

用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因________________________________________________________________________，构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是_______________________________识别结合位点。

（4）检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取________________________________________技术。

干扰素是动物或人体细胞受病毒感染后产生的一类糖蛋白，具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。回答下列问题：

(1)干扰素的作用机理是：干扰素作用于宿主细胞膜上的相应受体，激活细胞核中基因表达产生多种抗病毒蛋白，其中有些蛋白可通过激活____________使病毒的RNA水解；有些则可与__________(细胞器)结合，通过抑制病毒多肽链的合成发挥抗病毒作用。

(2)利用基因工程产生干扰素的方法之一：利用________酶将干扰素基因与牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件连接在一起构建基因表达载体，采用__________的方法导入牛的受精卵细胞中，经胚胎早期培养至________________期，移植入母体内发育成熟，即可获得能产生干扰素的转基因牛。

(3)由于干扰素在体外保存困难，可利用蛋白质工程对干扰素进行改造，基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

（1）应用胚胎工程技术可以培育出“试管牛”。试管牛的培育需经过体外受精、                    、                 以及在母体中发育和产出等过程。
（2）在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子进行处理，使其            。另外，培养的卵母细胞需要发育至减数第二次分裂的中期，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和               。
​（3）利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。基因工程的四个基本操作步骤是               、基因表达 载体的构建、                   和                     。若要获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、            、             、            和复制原点等。将该基因表达载体导入受体细胞所采用的方法是              （显微注射法、农杆菌转化法），为 获得能大量产生人干扰素的转基因牛，该基因表达载体应导入的受体细胞是           （受精卵、乳腺细胞）。

I:下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：

（1）玫瑰精油适合用_________________法提取，其理由是玫瑰精油_________________________。蒸馏时收集的蒸馏液__________ （是、不是）纯的玫瑰精油。

（2）蒸馏瓶中的水和原料量比例为_________，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有_________________和____________________。

（3）如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会__________，原因是_____________________。

II:Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞。科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗。其技术流程如下图：

（1）步骤①中所选的卵母细胞应处于______________期。

（2）步骤②中，重组胚胎培养到囊胚期时，可从其______________分离出ES细胞，ES细胞在形态上表现为____________________的特点。

（3）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的____________________。可以根据Rag2基因的核苷酸序列设计合成____________________，利用______________技术扩增Rag2基因片段。用HindⅢ和PstⅠ限制酶分别在目的基因所在DNA片段两侧进行酶切获得Rag2基因片段。为将该片段直接连接到表达载体，所选择的表达载体上应具有_______________________酶的酶切位点。

（4）为检测Rag2基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质，用抗Rag2蛋白的抗体进行________________________________。

（2）模型是人们为了某种特定目的对认识的对象所做的一种简化的概括性描述，模型构建是生物学教学、研究和学习的一种重要方法。图乙是基因工程的操作流程图，图中D表示_____________。若图乙表示单克隆抗体制备过程，则从A、B到C的过程需要的生物方法是使用___________________。

（3）有人提出用细胞核移植技术构建重组细胞来生产单克隆抗体，试用相关的图示及文字（括号中填文字）完善图丙表示该过程：

（4）高等哺乳动物受精后不久，受精卵开始进行细胞分裂。经桑椹胚、囊胚、原肠胚和组织器官的分化，最后发育成一个完整的幼体，完成胚胎发育的全过程。图中②、③依次为_________，胚胎从①中伸展出来的过程叫做____________。若要对图所示胚胎进行胚胎分割，则正确的操作方法的是图中的_________。