下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒(TMV)基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图所示，请据图回答下列问题。

(1)科学家首先从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的RNA，然后合成目的基因。图中过程①表示________，获得的DNA必须在两侧添加________和终止子，还要添加________酶能识别切割的碱基序列。

(2)由图分析，在过程③构建的重组Ti质粒上应该含有的标记基因是________基因，重组Ti质粒导入烟草体细胞的方法是________。

(3)在过程⑤培养基中需要添加卡那霉素、植物必需的各种营养成分和植物激素，以保证受体细胞能培养成再生植株。其中过程⑤添加卡那霉素的作用是________。

(4)在个体水平的鉴定过程中，可通过________的方法来确定植株是否具有抗性。

(1) 基因工程中运用的基因载体必需的元件有启动子、终止子、____、____等。 

(2) 过程②利用了“假病毒颗粒”具有____和能将DNA整合到受体细胞染色体DNA上特点。与正常病毒相比较,这种“假病毒颗粒”的主要特点是________

(3) 科学家利用ES细胞培育出转基因动物依据的主要原理是_________________,在利用合成培养基培养ES细胞时,还要加入______等天然成分。 

(4) 经鉴定,某嵌合小鼠产生的配子中有1/2带有外源基因,请写出利用该嵌合小鼠培育纯合转基因小鼠的思路:_________。 

屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法而获得诺贝尔奖。寄生于人体细胞内的疟原虫是疟疾的病原体。科学家通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产高效植株，进行基因测序发现该植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变。

（1）如果用高产青蒿关键酶基因的mRNA反转录产生的cDNA片段与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群叫做青蒿的___________；获得的cDNA与青蒿细胞中该基因碱基序列_________(填“相同”或“不同”）。在提取RNA时需要向提取液中添加RNA酶抑制剂，其目的是___________。

（2）将获得的突变基因导人普通青蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答：

用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时不能使用Sma Ⅰ切割，原因是__________。构建重组质粒时，在其目的基因前需要添加特定的启动子，启动子的作用是________________。

（3）转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是用____________方法检测受体细胞染色体DNA上是否插入目的基因，其次需要用_____________方法检测目的基因是否转录出了mRNA。最后，还要检测人乳铁蛋白是否成功表达。

(1) 过程①注射的A物质是指________________________

(2) 过程③需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，其目的是________。

(3) 基因工程技术引起的生物变异属于可遗传变异中的________。

(4) 过程③中构建的基因表达载体除了含有目的基因外，在组成上还需要含有            。

(5) 过程④中，受精卵一般作为动物基因工程的受体细胞，除了因为受精卵的具备全能性外，还有什么优点？         。

R－7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA，可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3′－UTR)结合，进而影响基因的表达。为研究R－7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达，科研人员将基因B中对应3′－UTR的DNA片段与荧光素酶基因(R－7不影响荧光素酶基因的表达)重组后导入家蚕胚胎细胞观察其表达结果。请回答：

(1)利用PCR技术扩增基因B对应3′－UTR的DNA片段，应先依据该基因的一段核苷酸序 列合成______________________。

(2)利用_____________________________________酶可将上述DNA片段插入荧光素酶基因表达载体(如图)上的位点_____________，构建重组载体。

(3)将重组载体与R－7共同导入家蚕胚胎细胞，同时应设置两个对照组，即将_____________________、_____________________分别导入两组家蚕胚胎细胞。

(4)科研人员分别从实验组和对照组细胞中提取________________，经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下，荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并发出荧光)，其结果如图。

(4)依据实验结果可推断，R－7影响基因B的表达，即通过遵循______原则，R－7与基因B所转录的mRNA的3′－uTR结合，进而__________(填"促进"或"抑制")基因B的表达。

如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答：

(1)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程?___________。为什么?_______________。

(2)过程②必需的酶是_____________酶。

(3)在利用A、B获得C的过程中，一般用______________切割A和B，使它们产生___________，再加入________________，才可形成C。

(4)由此可知，基因工程操作一般要经过A的获取、________(填字母)和________(填字母)的结合、_________(填字母)导入D、目的基因在大肠杆菌中表达与检测四个步骤。

下图是利用转基因技术生产干扰素的简化流程。请分析回答：

(1)过程①使用的         酶能使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的           （化学键）断开。过程②需要用到        酶。

(2）A上应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动干扰素基因转录，该部位称为_____________。为直接检测干扰素基因是否转录，可从细胞中提取 ________与用放射性同位素标记的____________作探针进行分子杂交，。

(3) 利用PCR扩增仪大量扩增目的基因的前提是目的基因的核苷酸序列要有一段是已知的，以便根据这一序列合成           ，除了该物质和目的基因外，扩增仪中还需加入四种脱氧核苷酸和          酶，并适时调整温度，才能使目的基因数量成指数式

在生命科学的研究中，基因重组已经不仅是研究的目的，而且日益成为一项重要的研究手段，所以有着不可替代的地位。如图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答：

(1)基因工程中，获取目的基因的主要途径包括直接分离法和______________。

(2)步骤①和②中常用的工具酶是_____________和_____________。

(3)图中质粒上有抗青霉素V钾和抗红霉素两个标记基因，认真观察经过步骤①和②后，有些质粒上的____  _______基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。

(4)为了促进步骤③的进行，一般要用_________________处理大肠杆菌。

(5)步骤④中，将锥形瓶内的大肠杆菌接种到含红霉素的培养基A上培养，目的是筛选含_________________________的大肠杆菌，能在A中生长的大肠杆菌有_______种。

(6)步骤⑤中，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含青霉素V钾和红霉素)和C(含红霉素)两个培养基上，一段时间后，在培养基________(B、C)上会出现含目的基因的菌落。

【生物——选修3：现代生物科技专题】

科学家利用生物工程技术，探究猪骨形态发生蛋白15(bmP15)基因具有表达特异性和示踪干细胞诱导分化为类卵母细胞的潜能。通过扩增猪bmP15基因的启动子片段与增强型绿色荧光蛋白（EGFP)基因构建表达载体，该工程技术基本流程如下图。请回答下列问题：

（1）利用___________技术扩增bmP15基因的启动子片段的前提是要有一段已知核苷酸序列，以便合成__________。

（2）过程①中，应先用限制酶________________处理表达载体1,以便插入bmP15基因的启动子构建表达载体2。

（3）过程②中，常采用___________技术将表达载体2成功导入受体细胞。

（4）培养受体细胞时，通常需在培养液中添加一定量的___________，以防污染；还需通入一定浓度的C0₂,目的是_________________。

（5）在实验结果的基础上，利用标记的_______基因作探针，与猪羊水干细胞的mRNA进行分子杂交，可进一步探究猪bmp基因特异性表达的原因。

（6）实验说明，bmP15基因启动子调控下EGFP基因在____________细胞表达。