​（5）如果利用上述方法培育出的蕃茄不具抗软化性状，经分子杂交技术检测，发现细胞内有抗PG存在，但检测不到mRNA2分子，可能原因是目的基因（抗PG）上游缺少___________。

下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯徳毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资枓：

资料1：巴斯德毕赤酵母菌可用培养基中甲醇作为其生活的唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达（5′AOX1和3′AOXl（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子）。

资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中已实现表达。

资料3:限制酶酶切位点

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应在图2中HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______限制酶识别序列，这样可避免质粒和目的基因自身环化。

（2）为确认巴斯德毕赤酵母茵转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用___________方法进行检测。

（3）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入___________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。   

（4）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行___________并分泌到细胞外，便于提取。

（5）下图为HBsAg某DNA片段一条链的碱基排列顺序。其中图1的碱基排列顺序已经解读，其顺序是:GGTTATGCGT，请解读图2显示的碱基排列顺序：______________________。

如图是以二倍体水稻(2N=24)为亲本的几种不同育种方法示意图，回答下列问题：

（1）A～D表示的育种方法依据的原理是_________， 过程B常采用____________的方法来获取单倍体幼苗，从细胞的角度分析，其依据的生物学原理是__________。

（2）E方法获得所需品种成功率最低的原因是_____________，C和F过程常用一定浓度的________处理，其原理是___________________________。

（3）若亲本的基因型有以下四种类型：

①两亲本杂交，后代表现型为3︰1的杂交组合是_________________。

②选乙、丁为亲本，经A、B、C途径可培育出_______种纯合植物，该育种方法突出的优点是_____________________________。

“白菜―甘蓝”是科学家用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长周期短，耐热性强和易储存等优点。下图是“白菜―甘蓝”培育过程示意图，请完成下列问题：

（1）培育成白菜―甘蓝植株，采用的技术手段是_________________。该过程应用的原理是______________________________________。
（2）在a过程中诱导原生质体融合的方法有____________________________，经此过程产生的细胞类型有3种。
（3）要获得上图中白菜和甘蓝的原生质体，首先需要分别除去白菜和甘蓝细胞的细胞壁。现提供以下材料和用具：紫色洋葱鳞片叶、适宜浓度的蔗糖溶液、纤维素酶和果胶酶、蒸馏水、镊子、显微镜、载玻片等。在实验过程中要选取适宜浓度的蔗糖溶液而不用蒸馏水的理由是：__________________。

（4）采用特异性引物对另两种植物花椰菜和黑芥基因组DNA 进行PCR 扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种及纯种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1—4 进行PCR 扩增的结果。据图判断，再生植株1—4 中一定是杂种植株的是__________。

为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜叶片细胞并获得了转基因油菜品种．

（1）从陆地棉基因文库中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因，然后利用_________技术分别进行扩增．

（2）如图甲，选用图中的限制酶__________处理两个基因后再用_______酶处理，得到___________（填图中字母）端相连的融合基因．

（3）将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的T﹣DNA中，构建______________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含      _____的固体培养基上培养得到单菌落，再利用液体培养基震荡培养，得到用于转化的浸染液．

（4）剪取油菜的叶片放入浸染液中一段时间，此过程的目的是_______________，进一步筛选后通过__________________技术获得转基因油菜植株。

（5）用DNA﹣RNA分子杂交技术确定融合基因是否完成了___________。

在菲律宾首都马尼拉郊外的一片稻田里，一种被称为“金色大米”的转基因水稻已经悄然收获。这种转基因大米可以帮助人们补充每天必需的维生素A。由于含有可以生成维生素A的β胡萝卜素，它呈现金黄色泽，故称“金色大米”。“金色大米”的培育流程如图所示，请回答下列问题。（已知酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—）。

（3）过程d采用__________________法，过程e运用了_________________技术，在该技术应用的过程中，关键步骤是利用含有一定营养和激素的培养基诱导植物细胞进行________________________。

如图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列问题。

(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—^↓GATC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶____切割质粒，用限制酶_____切割抗虫基因。①过程在_________(填“体内”或“体外”)进行。

(2)通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若大肠杆菌能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。该培养基从功能方面属于____培养基。

(3)重组质粒导入大肠杆菌的目的是__________________。

(4)⑤过程所用技术称为_______________，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有_     _    __。

如图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答：(每空1分共10分)

(1)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程?___________。为什么?_______________。 

(2)过程②必需的酶是_____________酶。

(3)在利用A、B获得C的过程中，一般用______________切割A和B，使它们产生___________，再加入________________，才可形成C。

(4)由此可知，基因工程操作一般要经过A的获取、________(填字母)和________(填字母)的结合、_________(填字母)导入D、目的基因在大肠杆菌中表达与检测四个步骤。