图示方案为人们获得生物新品种的过程，请回答下列问题：

方案Ⅰ：抗冻蛋白基因烟草细胞―→抗冻烟草

方案Ⅱ：A基因免疫过的B细胞―→体外培养―→单克隆抗体

方案Ⅲ：人的生长激素基因牛的受精卵―→早期胚胎受体母牛―→转基因牛

(1)基因工程的核心步骤是________________。农杆菌转化法中，根据农杆菌的特点，如果将抗冻蛋白基因插入________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入植物细胞中________上。

(2)推测方案Ⅱ中A基因所起的作用是________，请写出该方案获得的细胞中遗传信息传递时所遵循的法则____________________________。

(3)方案Ⅲ中的转基因牛可以通过分泌乳汁来生产人的生长激素。这需要将人的生长激素基因与________的启动子等调控组件重组在一起。该方案中的早期胚胎在移植入受体母牛子宫之前，必须进行性别鉴定，一般是取处于________时期的________细胞进行检测。

回答下列（一）、（二）小题。

(一）某研究小组欲用苹果汁为原料，利用发酵瓶制作果酒和果醋，请分析回答：

(1)将苹果汁放入发酵瓶，要预留约________的空间。为得到酒精和糖含量较高的果酒，可在果汁中加入一定比例的______。若发酵瓶内持续无气泡产生，则需加入更多的_______，使发酵作用尽快发生。

(2)变酸的果酒表面有一层醋杆菌形成的菌膜，若要在该菌膜中筛选高表达量的醋杆菌菌株，可通过获得_______的方法来分离筛选。若要统计获得菌种的数目，则常采用_________法。对获得的优质醋杆菌菌种常用划线法接种在固体培养基______上低温保存。

(3)下图是果酒和果醋的发酵装置，关于果醋发酵叙述错误的是_______

A.发酵前，瓶内酒—冰混合物的pH需调至7.0

B.发酵过程中，充气口要适时适量充气

C.发酵过程中，排气口排出醋酸发酵产生的CO₂

D.发酵完成后，出料口的pH值不再减少

 (二）请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。

(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时，利用一定的物质，如生物诱  导剂_____作介导，使经免疫的小鼠脾细胞与________细胞融合，筛选出融合的细胞再进行细胞的______培养，获得纯系细胞，同时还要进行________检验，以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。

(2)有关杂交瘤细胞体外培养的叙述，正确的是________

A.用固体培养基培养          B.用滋养层细胞支持生长

C.能进行传代培养            D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物

(3)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体，科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导人到受体细胞，该技术的核心步骤是______________,噬菌体是这些关键基因的___________。

T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T₁代）。

（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除_______________，因为后者产生的

_________会抑制侧芽的生长。

（2） 为筛选出已转化的个体，需将T₁代播种在含____________的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T₂ 代）。

（3） 为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T₂代播种在含___________的培养基上，获得所需个体。

（4）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性______。

（5）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是：提取_________植株的DNA，用限制酶处理后，再用__________将获得的DNA片段连接成环（如图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取____________作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

下图为吉林大学农学部奶牛繁育基地成功培育出的一头携带转入赖氨酸基因的克隆牛“织女”的大致过程，请据图回答问题:

嗜热菌可以生活在98℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA^↓TATG、G^↓AATTC、A^↓AGCTT、G^↓TCGAC。请分析回答：

(1)图中的结构A是________，其主要作用是________。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有________。

(2)用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有________(多选)。

①反应温度 ②缓冲液pH ③限制酶的浓度 ④DNA样品的纯度

(3)实验中发现，重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加________，整个实验过程应保持________操作。

(4)PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是________。

A.引物Ⅰ：···GGGAATTC···；引物Ⅱ：···CTCATATG···

B.引物Ⅰ：···GAATTCCC···；引物Ⅱ：···CATATGAG···

C.引物Ⅰ：···GGAAGCTT···；引物Ⅱ：···AAGCTTCC···

D.引物Ⅰ：···CTCATATG···；引物Ⅱ：···AAGCTTAAGCTT···

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）能够高效表达外源基因。科学研究中常使用重组CHO细胞（导入了重组载体的CHO细胞）大量生产外源蛋白，一般步骤为：Ⅰ．长期传代培养，获得大量重组细胞；Ⅱ．批式培养，获得大量外源蛋白。

（1）体外培养动物细胞的基本培养液（BM）中除抗生素和一般营养物质外，还应含有_________。为了获得能生产抗体A的重组CHO细胞，需要将含有抗体A基因的重组载体通过__________法导入CHO细胞，经筛选获得重组CHO细胞。

（2）研究发现，酵母抽提物（YE）在动物细胞培养和促进蛋白质表达中具有重要作用。为确定YE在不同培养阶段的使用策略，研究人员进行了下列实验。

①图1所示实验探究了在长期传代培养阶段__________对重组CHO细胞增殖以及抗体A表达量的影响。通过细胞计数和计算得出实验结果如图2所示，结果说明___________。

此处理对后续批式培养中的细胞增殖及单个细胞的抗体产量基本无影响。

②进一步探究YE对批式培养阶段的影响，应在阶段Ⅰ、Ⅱ分别使用________和__________进行培养。结果表明，抗体A的总产量随着YE浓度的提高而增加。

③综上所述，为提高抗体A的总产量，整个培养过程中对YE的使用策略是____________。

菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答：

（注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）

（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是_        __，此外还可用                 作为载体。

（2）下图限制酶M和N切割产生的黏性末端是__ ____ ____ __，连接它们所需要的基本工具是__              ________。

（3）为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用__  _____处理，使其处于感受态。

（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及___________和  ________ 的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。

（5）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据抗虫基因（目的基因）两端的部分碱基序列设计特异引物，若其中一种引物共用了31个，则目的基因最多扩增了__  __次。

（6）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如下表所示。

请据表回答：

①对照组应饲喂等量的__                ________                __。

②据表分析，__               ____            __差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

【生物——选修3：现代生物科技专题】

神经营养因子（NTF）能促进神经元的存活和再生。已知NTF基因能得到克隆。回答下列问题：

（1）在体外，可通过PCR技术扩增NTF基因，该技术依据的原理是______________。为何保证PCR反应的进行，反应体系需要加入______________酶、模板DNA、dCTP、dATP、dGTP、dTTP、______________等。在打开DNA双链时需要_______________________。

（2）将外源NTF基因导入受体细胞常用的方法是_____________，检测其是否已表达，可采用______________方法。

（3）与转基因工程菌相比，利用真核细胞作为受体得到的NTF才有生物活性，其原因可能是______________。

下面是一项“利用转基因番茄生产人胰岛素的方法”的专利摘要，请回答：

本发明利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物偏爱密码子的原则来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在C端加上KDEL的内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于CaMV 35S启动子和果实专一性启动子2A12的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。

  （1）此基因工程中的目的基因是________________________，将人工合成的DNA片段拼接在一起，所需要的酶有________________________________。

  （2）要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用_________技术。

  （3）试分析在C端加上KDEL的内质网滞留序列，为什么可以避免胰岛素在植物细胞中的降解？_____________________________________________________。

  （4）用目的基因与农杆菌的Ti质粒结合构建表达载体，该表达载体的组成中不应含有的是_________（从下列选项中选择）。

①目的基因  ②CaMV 35S启动子 ③果实专一性启动子2A12  ④RNA引物 

⑤标记基因  ⑥T-DNA           ⑦RNA聚合酶基因片段     ⑧终止子

人的血清蛋白在临床上需求量很大，通常从血中提取。由于艾滋病等人类传染病造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品心存疑虑。生物技术的发展与应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，如图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的流程。根据下图回答：

（1）雌性奶牛胚胎细胞是（   ）

A．雌性奶牛产生的卵细胞

B．雌性奶牛体内的受精卵

C．能发育成雌性奶牛的受精卵

D．从奶牛胚胎上取出的细胞，这个奶牛胚胎将发育成雌性奶牛

（2）将人的血清蛋白基因导入奶牛胚胎受体细胞时，常用方法是                ；

（3）小牛1、2、3的性别是              性，性状              。

（4）人体血清蛋白基因的表达要经历              和              两个过程，该基因能够在小牛体内表达产生人的血清蛋白，说明生物共用一套            

（5）此操作流程涉及的现代生物技术有动物细胞培养、              、              等。