回答下列（一）、（二）小题。

(一）某研究小组欲用苹果汁为原料，利用发酵瓶制作果酒和果醋，请分析回答：

(1)将苹果汁放入发酵瓶，要预留约________的空间。为得到酒精和糖含量较高的果酒，可在果汁中加入一定比例的______。若发酵瓶内持续无气泡产生，则需加入更多的_______，使发酵作用尽快发生。

(2)变酸的果酒表面有一层醋杆菌形成的菌膜，若要在该菌膜中筛选高表达量的醋杆菌菌株，可通过获得_______的方法来分离筛选。若要统计获得菌种的数目，则常采用_________法。对获得的优质醋杆菌菌种常用划线法接种在固体培养基______上低温保存。

(3)下图是果酒和果醋的发酵装置，关于果醋发酵叙述错误的是_______

A.发酵前，瓶内酒—冰混合物的pH需调至7.0

B.发酵过程中，充气口要适时适量充气

C.发酵过程中，排气口排出醋酸发酵产生的CO₂

D.发酵完成后，出料口的pH值不再减少

 (二）请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。

(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时，利用一定的物质，如生物诱  导剂_____作介导，使经免疫的小鼠脾细胞与________细胞融合，筛选出融合的细胞再进行细胞的______培养，获得纯系细胞，同时还要进行________检验，以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。

(2)有关杂交瘤细胞体外培养的叙述，正确的是________

A.用固体培养基培养          B.用滋养层细胞支持生长

C.能进行传代培养            D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物

(3)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体，科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导人到受体细胞，该技术的核心步骤是______________,噬菌体是这些关键基因的___________。

T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T₁代）。

（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除_______________，因为后者产生的

_________会抑制侧芽的生长。

（2） 为筛选出已转化的个体，需将T₁代播种在含____________的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T₂ 代）。

（3） 为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T₂代播种在含___________的培养基上，获得所需个体。

（4）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性______。

（5）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是：提取_________植株的DNA，用限制酶处理后，再用__________将获得的DNA片段连接成环（如图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取____________作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

嗜热菌可以生活在98℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA^↓TATG、G^↓AATTC、A^↓AGCTT、G^↓TCGAC。请分析回答：

(1)图中的结构A是________，其主要作用是________。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有________。

(2)用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有________(多选)。

①反应温度 ②缓冲液pH ③限制酶的浓度 ④DNA样品的纯度

(3)实验中发现，重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加________，整个实验过程应保持________操作。

(4)PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是________。

A.引物Ⅰ：···GGGAATTC···；引物Ⅱ：···CTCATATG···

B.引物Ⅰ：···GAATTCCC···；引物Ⅱ：···CATATGAG···

C.引物Ⅰ：···GGAAGCTT···；引物Ⅱ：···AAGCTTCC···

D.引物Ⅰ：···CTCATATG···；引物Ⅱ：···AAGCTTAAGCTT···

研究人员从血管内皮瘤中发现了一种新的血管增生抑制剂——内皮抑素，它能有效地抑制血管增生。下面是获得重组内皮抑素的方法，请分析回答下列问题。

（1）从肝细胞中分离出相应的RNA，经________法，获得内皮抑素基因，再经________过程进行扩增，以获得更多的目的基因。

（2）扩增的目的基因与pUC18质粒(如图所示)都用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，然后用DNA连接酶进行连接，构建重组质粒。双酶切不仅能避免了目的基因与载体的自身环化以及________连接，还减少了目的基因与目的基因、载体与载体的连接，提高了重组质粒的比例。

（3）大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X—-gal时，X-—gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入的物质有________和氨苄青霉素。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成________颜色的菌落，原因是_________________________。

（4）从选择培养基中挑取所需的单个菌落接种于液体培养基中培养，获得粗提表达产物。将等量毛细血管内皮细胞接种于细胞培养板，37 ℃培养。将等量不同浓度的粗提表达产物加进培养孔中，72 h后在显微镜下观察细胞存活情况并统计(或记录)活的内皮细胞数目，实验结果如下表所示。实验结果说明_______________________________________________________________。

嗜热菌可以生活在98 ℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA^↓TATG、G^↓AATTC、A^↓AGCTT、G^↓TCGAC。请分析回答：

(1) 图中的结构A是__________，其主要作用是提供_______________特异性识别结合位点，驱动基因转录。一个完整的基因表达载体的组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有______________。

(2) 用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用__________两种限制酶进行切割

(3) 将重组质粒导入大肠杆菌细胞之前，一般需先用______溶液处理大肠杆菌，以便将基因表达载体导入细胞。重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加__________，整个实验过程应保持____________操作。

(4) PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是________。

A. 引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…

B. 引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…

C. 引物Ⅰ：…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…

D. 引物Ⅰ：…CTCATATG…；引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…

（1）若分离以尿素为氮源的细菌。在含有___酶的细菌菌落周围会出现，这是由于尿素被分解产生的氨气使PH升高，______指示剂产生颜色变化。采用______法将发酵菌株固定在锯末上制成固定化菌株，可大幅缩短生产周期,降低生产成本和提高生产效率。

(2)亚硝酸盐测定原理:亚硝酸盐可与________________发生重氮化反应.这一产物再与____________________偶联,形成__________色产物。

（3）获得目的基因，获取已知目的基因序列用化学方法合成或_________________

基因工程的核心:通常用_________________分别切割目的基因和载体DNA，然后用________将目的基因和载体DNA连接在一起,形成重组DNA分子。

（4）卵巢经超数排卵处理后，要使用__________________确定卵泡的位置。     

 科研人员单独培养胚胎干细胞，首先需要在培养皿底部制备一层______细胞，称为饲养层。 利用动物细胞培养技术中的细胞具有________________和__________________的特点可用烧伤患者自身的健康皮肤细胞培养出大量自身薄层皮肤细胞，用于移植。

（5）植物克隆和动物克隆共有的培养方法是_______

A.原生质体培养、传代培养     B.贴壁培养、传代培养 

C.器官培养、愈伤组织培养     D.悬浮培养、器官培

菊天牛是菊花的主要害虫之一。科研人员将抗虫基因转入菊花，培育出抗虫菊花。下图是获得转基因菊花的技术流程。请据图回答：

（注：卡那霉素抗性基因（kan^R）作为标记基因，菊花叶片对卡那霉素高度敏感）

（1）质粒是基因工程中最常用的载体，其化学本质是_        __，此外还可用                 作为载体。

（2）下图限制酶M和N切割产生的黏性末端是__ ____ ____ __，连接它们所需要的基本工具是__              ________。

（3）为了促进土壤农杆菌吸收重组质粒，可用__  _____处理，使其处于感受态。

（4）将愈伤组织转移到添加一定浓度植物激素、营养物质以及___________和  ________ 的固体培养基中，在适宜条件下进行培养，筛选转基因菊花。

（5）用PCR方法检测转基因菊花是否含有目的基因时，需根据抗虫基因（目的基因）两端的部分碱基序列设计特异引物，若其中一种引物共用了31个，则目的基因最多扩增了__  __次。

（6）将转基因菊花嫩茎及叶片与人工饲料以适当比例混合后饲喂菊天牛2龄幼虫，实验结果如下表所示。

请据表回答：

①对照组应饲喂等量的__                ________                __。

②据表分析，__               ____            __差异显著，说明转基因菊花对菊天牛2龄幼虫有较强的毒杀作用。

白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有雌激素样作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。下图表示利用植物组织培养的方法生产白藜芦醇的过程。请分析作答：

外植体愈伤组织丛芽或根—→完整植株

(1)植物组织培养是在____________和人工控制条件下，将________的植物体器官、组织、细胞，在人工配置的培养基上培养成完整植株，利用的原理是______________________________________。

(2)植物组织培养的核心步骤为____________和____________。①和②过程需要的培养基的激素含量________(填“相同”或“不同”)。

 (3)利用细胞产物工厂化生产技术提取白藜芦醇需要将外植体培养至________，原因是此阶段的细胞分裂能力强，但白藜芦醇的产量一般较低，可以用______________________处理愈伤组织，再筛选产量提高的细胞进一步培养。

(4)将白藜芦醇的基因转入大豆等重要粮食作物和经济作物中，提高农作物的营养价值和品质。导入受体细胞时常用方法为_____________________，目的基因是否插入的检测方法为_____________________。

我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因（TaNHX2基因）转移到水稻细胞内，获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题：

（1）为保证目的基因在水稻细胞中能够表达，运载体上应含有特定的_______________（复制原点、启动子、标记基因）。

（2）水稻的转化过程为：将水稻幼胚接种到诱导培养基上，经过________过程，培养出________________________，然后用______________________法，将目的基因和相关功能片段整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，最后诱导形成水稻植株。

（3）为验证外源基因整合到水稻基因组后是否转录，可从转基因植株的细胞中提取所有mRNA并反转录成______________________，再以反转录产物为模板，进行基因扩增。若以根细胞为材料扩增结果为阳性（有产物生成），以叶细胞为材料扩增结果为阴性（无产物生成），则说明_______________________________________________________________

（4）将生长至4叶期的转基因幼苗转入____________________溶液中培养，进行耐盐试验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察现象，若___________________则说明转基因植株获得了耐盐特性。

请回答下列有关转基因抗病毒马铃薯的问题：

  （1）获取抗病毒基因常用的方法有______________________、_____________________________________、__________________________________。

  （2）获得转基因马铃薯的核心操作是_______________________________________，其中与调节抗病毒基因转录有关的部分是_______。

  （3）利用农杆菌转化法将抗病毒基因导入马铃薯，首先应将重组质粒导入_________，再将它与切成小圆片的马铃薯叶片共同培养，使插入在Ti质粒上的______________中的抗病毒基因可以转移至受体细胞，并整合到马铃薯的_________________________。

  （4）将共同培养后的马铃薯转移到特定的培养基上，在___________________________（填激素名称）的协同调控作用下，经过脱分化形成_________________，再分化得到胚状体或丛芽；对获得的植株进行个体生物学水平鉴定的做法是__________________________。