回答下列(一)、(二)小题：

    (一)牛奶是微生物生长的良好培养基。生鲜牛奶中的微生物情况反映了奶牛的健康状况，也影响奶制品的运输和贮藏；牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物。

    (1)为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图操作。用无菌吸管从三角烧瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，如此重复3次，将10 mL生牛奶稀释到10^－4浓度后，取0.1 mL滴在培养基上。

    ①将牛奶稀释液滴加在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是_______________。

    ②该涂布工具最合适的灭菌方法是_______________________。

    (2)图中所示方法为稀释培养法，按此方法培养得到的3个培养皿中菌落数分别为25个、23个、24个，则生牛奶中每毫升含细菌数为______个。

    (3)消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，若用稀释平板法检测消毒后牛奶是否含有细菌，则在操作步骤上应作什么改动?______________________。

    (4)涂布结束后将培养皿______，在37℃______________中培养。

    (5)细菌种群进化过程中，起主要作用的变异是______。

    A．环境条件    B．基因重组    C．基因突变    D．染色体变异

    (二)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转移入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力，请回答：

    (1)从兔肝细胞中提取mRNA，在_________酶的作用下形成互补DNA。然后以此DNA为模板在体外利用____________反应大量扩增，得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成___________，再导入用氯化钙处理的_______________，侵染矮牵牛叶片。将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是________________(A．叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织  B．愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽  C．再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根  D．愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。

    (2)取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中，将试管置于__________上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是__________，从而使叶片保持正常形态。

铁皮石斛是一种名贵中药材，有生津养胃、降血糖和增强免疫力等作用，有效成分为石斛多糖、石斛碱等，温州雁荡山素有“中国铁皮石斛之乡”的美誉。请回答下列问题：

（1）用茎快速繁殖铁皮石斛时，给茎消毒时无须使用的是__________ （填“乙醇”，“无菌水”，“甘露醇”或“次氯酸钠”）。在细胞分裂素相对较多和生长素相对较少的培养基中培养茎的切段，待长出较多的_____________ ，将其进行______________ （处理）后再转入__________培养基中继续培养，直至长成幼苗，之后再后将苗移至草炭土或蛭石中进行___________，再转移至土中定植。

（2）研究发现，铁皮石斛的生长发育与其体内的内生菌密切相关。为进一步研究内生菌的作用，需要大量的内生菌进行相关实验。分离内生菌时采用的最简便的方法是________ 。

A．G6玻璃砂漏斗过滤法              B．血细胞计数法

C．划线分离法                       D．涂布分离法

    再将纯化的内生菌转移到液体培养基中进行_____________ 。

（3）研究发现，质量浓度为200mg /L的卡那霉素能有效抑制铁皮石斛细胞的增殖与分化。科学家欲利用卡那霉素，采用农杆菌转化法对现有铁皮石斛品种进行基因改良。在基因工程操作中，对于要导入受体细胞的_____________ 应同时带有目的基因和_____________ 基因，这样才能利用含有卡那霉素的培养基将成功导入目的基因的受体细胞筛选出来。

（4）鉴定铁皮石斛的品质，可通过苯酚—浓硫酸法测定石斛多糖的含量。其原理是石斛多糖水解成单糖并脱水生成糖醛衍生物后，与苯酚缩合产生橙黄色化合物，在490nm处测定光密度值，以不同浓度的葡萄糖溶液为标准溶液建立标准曲线，便可知道样品中石斛多糖的含量。

（5）为高效提取石斛多糖，可在提取液中加入_____________ ，以提高铁皮石斛的出汁率。

乳头瘤病毒(HPV)持续感染可导致宫颈癌发生。科研人员将HPV外壳L1蛋白基因与在人体中不能复制但能有效表达外源基因的痘苗病毒重组，制备新型疫苗。

(1)用痘苗病毒感染鸡胚细胞，一段时间后洗去吸附的病毒，将鸡胚细胞转入液体培养基中培养，培养基中加入适量抗生素以避免________。在培养基中加入L1蛋白基因与质粒连接构建重组质粒，使L1蛋白基因与________在鸡胚细胞内发生DNA重组，得到重组病毒疫苗。依据L1蛋白基因序列设计引物扩增重组病毒DNA，以检测_______________________。

(2)为研究重组疫苗的保护作用，将生长发育状况一致的小鼠随机均分为三组，1组注射用PBS缓冲液配制的重组病毒疫苗100 μL,2组注射________作为对照，3组注射________作为空白对照。

(3)给上述三组小鼠皮下注射C3细胞(含有HPV基因的癌细胞)，观察、记录小鼠成瘤情况，结果如下。

据实验结果分析，尽管各组小鼠都可成瘤，但实验组小鼠__________________________，说明重组病毒疫苗具有一定的免疫保护作用。接种重组病毒疫苗的小鼠体内表达________作为抗原，刺激机体产生特异性免疫。皮下注射C3细胞时，HPV引起________细胞迅速增殖、分化，产生大量抗体，从而起到免疫保护作用。根据免疫学知识，注射疫苗后，只有诱发出机体的________免疫，才能有效清除癌细胞。

(4)若欲检验重组病毒疫苗是否有治疗作用，对小鼠进行的处理最恰当的是________(选填下列字母)。

A．先注射HPV病毒，一段时间后注射重组病毒疫苗

B．先注射重组病毒疫苗，一段时间后再注射HPV病毒

C．先注射C3细胞，一段时间后注射重组病毒疫苗

D．先注射重组病毒疫苗，一段时间后再注射C3细胞

T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T₁代）。

（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除_______________，因为后者产生的

_________会抑制侧芽的生长。

（2） 为筛选出已转化的个体，需将T₁代播种在含____________的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T₂ 代）。

（3） 为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T₂代播种在含___________的培养基上，获得所需个体。

（4）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性______。

（5）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是：提取_________植株的DNA，用限制酶处理后，再用__________将获得的DNA片段连接成环（如图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取____________作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

科学家从链霉菌提取抗除草剂基因(bar基因)，用来培育抗除草剂作物。回答下列问题：

(2)将种子的胚划伤，简称划胚。请说出农杆菌将bar基因导入划胚细胞的过程：____________________________________________。

(3)某兴趣小组要探究各种划胚方式(包括横划、纵划和穿刺)对bar基因导入大豆种子胚细胞效率的影响。请将有关实验步骤补充完整。

步骤1：_______________________________________________中培养23天。

步骤2：用_____________________技术鉴定萌发植株的细胞是否导入bar基因。

(4)下表是不同植物对除草剂耐受性研究的实验结果。据表分析可知，玉米对除草剂耐受性最大，判断依据是_____________________________。

科学工作者将抗虫毒蛋白基因通过载体转入棉花细胞，获得了很好的抵抗棉铃虫的作用。在研制抗虫棉的过程中，利用标记基因，可以快速检查基因表达载体是否导入棉花细胞，然而，即使基因表达载体已经导入棉花细胞，也不能确定转基因过程已经取得成功。因此，在该项工程的最后阶段，需要做如下一系列检测：

（1）用放射性同位素标记的________________________________作探针，可以分别检测棉花细胞中是否有_____________________________________。

（2）向棉花细胞的匀浆中加入特定的________，可以检测棉花细胞中是否能够产生抗虫毒蛋白。

（3）除了上述分子水平的检测外，还需要做个体水平检测。其方法是____________________________________________________________。

（4）我国西北的一些地区年降雨量很小，只适宜种植少数的草本植物，但却被硬性规定种植转基因的抗虫棉，结果造成减产。这个案例主要违背了生态工程的________________原理。

（5）一般来说，生态工程的主要任务是对_________________________________进行修复，对造成环境污染和破坏的生产方式进行改善，并提高生态系统的生产力。

科学家运用基因工程技术将结核杆菌MPT64基因（能控制合成MPT64蛋白）成功导入胡萝卜细胞，最终表达出肺结核疫苗。请回答下列问题：

（1）为获取MPT64基因，可从结核杆菌的细胞中提取对应mRNA，在               的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与结核杆菌中该基因碱基序列             (填“相同”或“不同”)。

（2）通常采用           扩增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成               ，在操作步骤中需要加热至90-95℃的目的是                   。

（3）根据农杆菌的特点，如果将MPT64基因插入到              上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入胡萝卜细胞。要确认MPT64基因是否在胡萝卜植株中表达，应检测胡萝卜植株中是否含有                。

（4）研究发现，如果将MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，其保存时间将大大延长，科学家可以生产上述耐储存的MPT64蛋白的现代生物工程技术是                   。

①骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能无限增殖

②骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体

③B淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖

④B淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合才能产生抗体

下图表示科学家采用不同方法培育良种牛的过程, a~h为操作过程,请据图回答有关问题:

(1)“试管牛”技术的操作流程是 (填字母)。

(2)d操作的名称是________,受体子宫内胚胎发育的过程中,细胞不断分裂,其分裂方式为________ 。

(3)图中所示的过程中用到的激素是________,其目的是获得更多的卵母细胞,经受精后可得到早期胚胎;图中早期胚胎属于胚胎发育的________阶段,其中胚胎干细胞来源于________(填数字标号)。

(4)过程h常用的方法是________。

马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻、玉米的第四大粮食作物，目前广泛种植于世界各地。由马铃薯Y病毒（PVY）等引起的病毒性退化导致世界马铃薯产量每年至少减产20%。研究表明，表达病毒外壳蛋白基因（PVY－CP）的转基因马铃薯能显著延缓病害症状的发展和危害程度。目前，该转基因抗病毒马铃薯已经在云南试种成功。请回答下列问题：

（1）PVY－CP在基因工程中称为 。将PVY－CP导入马铃薯细胞采用最多的方法是        。

（2）取40株扩繁后的转基因马铃薯作为实验组，另取40株 作为对照组，种植于相同且适宜的条件下，接种 ，观察发病情况，以确定转基因马铃薯是否具有抗性以及抗性的程度。

（3）成功获得抗PVY马铃薯后，可采用          技术进行大批量繁育，其理论依据是     ；一些分化的马铃薯细胞，经过激素的诱导，可以 形成具有分生能力的薄壁细胞，进而形成 ；再经过         形成胚状体，幼根或牙进一步培养成植株。