融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如下图1所示。下图2是中间载体1和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于载体外侧），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题。

（1）图1第一阶段中PCR至少进行____________次循环，才能获得双链等长的含引物2的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的____________关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。
（2）若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计__________种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有__________种。
（3）图2中需使用__________（填限制酶）和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整合表达载体上未标出的结构是__________。

（4）叶绿体定点整合表达载体中_____________________________________________（填基因）能使目的基因准确插入叶绿体DNA上的特定位点上。与利用农杆菌转化法相比，利用定点整合表达载体将目的基因导入叶绿体中的优点是____________________________________。

下列各组中酶的作用相似的是（ ）

利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）．图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础．以下叙述错误的是（ ）

下图1为某种常用质粒的序列图，Lac Z基因编码的酶能使无色的X—gal变为蓝色，Amp^r为氨苄青霉素抗性基因。图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。请回答下列问题：

⑴若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有________和________。基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有_______、终止子和标记基因等。对获取的目的基因可用________技术对其扩增。

⑵实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了________；若大肠杆菌菌落显白色，说明导入了________。没有导入任何外源DNA的大肠杆菌________（填“能”或“不能”）在该培养基上生存。

⑶将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，若仅考虑质粒与目的基因相连接，会有   种连接方式。然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为________kb（已知目的基因的长度大于2kb，1kb＝1000个碱基对）。

金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。

（2）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。

（3）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏引物与模板之间的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。

（4）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。

美国科学家Sanger因发明了链终止DNA测序法而再获诺贝尔奖。通过向DNA复制体系中加入能够终止新链延伸的某种脱氧核苷酸类似物，可以得到各种不同长度的脱氧核苷酸链，再通过电泳呈带(按分子量大小排列)，从而读出对应碱基的位置。下图表示测定DNA新链中腺嘌呤位置的操作方法，据图作答：

(1)操作的第一步是通过加热破坏______________从而使DNA分子的双链打开，在细胞中，这一过程是在___________酶的作用下完成的。

(2)根据图中的模板链，对应合成的最长新链的碱基序列是(自上而下读出)：______________。

(3)要通过以上操作精确地测出DNA链上每一个碱基的位置，电泳分离结果必须能把____________区分开来。

(4)为了能够从电泳结果直接读出模板链中鸟嘌呤的位置，进行以上操作时，应加入什么标记物？__________________。扩增后将产生几种带标记的新链？____________________。

（1）图中cDNA文库         基因组文库（选填“大于”或“等于”或“小于”）。

（2）①过程提取的DNA需要         的切割。

（3）为在短时间内大量获得目的基因，可用的技术是       ，其原理是                。该反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg²⁺）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、_____________和_________________。

（4）目的基因获取之后，需要进行基因表达载体的构建，基因表达载体的组成必须有______         及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。

（5）将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是         ，检测目的基因是否导入受体细胞、是否翻译出相关的蛋白质时所用的方法分别是_________________、_________________技术进行检测。

①含目的基因的DNA片段 　　②引物 　　  ③四种脱氧核苷酸

   ④热稳定DNA聚合酶          ⑤mRNA　    ⑥核糖体