中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）能够高效表达外源基因。科学研究中常使用重组CHO细胞（导入了重组载体的CHO细胞）大量生产外源蛋白，一般步骤为：Ⅰ．长期传代培养，获得大量重组细胞；Ⅱ．批式培养，获得大量外源蛋白。

（1）体外培养动物细胞的基本培养液（BM）中除抗生素和一般营养物质外，还应含有_________。为了获得能生产抗体A的重组CHO细胞，需要将含有抗体A基因的重组载体通过__________法导入CHO细胞，经筛选获得重组CHO细胞。

（2）研究发现，酵母抽提物（YE）在动物细胞培养和促进蛋白质表达中具有重要作用。为确定YE在不同培养阶段的使用策略，研究人员进行了下列实验。

①图1所示实验探究了在长期传代培养阶段__________对重组CHO细胞增殖以及抗体A表达量的影响。通过细胞计数和计算得出实验结果如图2所示，结果说明___________。

此处理对后续批式培养中的细胞增殖及单个细胞的抗体产量基本无影响。

②进一步探究YE对批式培养阶段的影响，应在阶段Ⅰ、Ⅱ分别使用________和__________进行培养。结果表明，抗体A的总产量随着YE浓度的提高而增加。

③综上所述，为提高抗体A的总产量，整个培养过程中对YE的使用策略是____________。

    (一)要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种，一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养、并利用纯化技术得到单菌落的菌种。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题：

    (1)对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养，一般用LB培养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源的物质主要是__________，为调节渗透压，要加入一定量的___________。为进行大肠杆菌的分离，还要加入琼脂配制成固体培养基，并进行倒平板的操作。

    (2)获得纯净微生物培养物的关键是_____________________，为此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用_____________________法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌。同时在接种或倒平板操作时，除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外，还必须_________________________，以防止空气中的杂菌污染。

    (3)大肠杆菌菌种的扩大培养一般采用液体培养基，接种后将培养基置于37℃摇床振荡条件下培养12小时。菌种的分离时一般在固体培养基上采用____________法，并将培养皿_______________状态。

    (二)科学家将蜘蛛的蛛丝基因导入山羊体内，创造出转基因山羊，使羊奶中含有一种独特的蛛丝蛋白。生产原理如下图。请回答：

    (1)将蛛丝蛋白基因和质粒通过甲过程形成的X物质为_____________。如果选取的受体细胞为体细胞，当在培养过程中出现接触抑制现象时，需要进行____________培养。要使重组细胞具有发育的全能性，乙过程需要的技术操作是____________。

    (2)下列关于丙过程的叙述，正确的是______。

    A．该过程为动物细胞培养，目的是获得更多的重组细胞

    B．该过程所用培养液的成分往往是相同的

    C．该过程在无菌条件下进行，需要提供CO₂来调节pH

    D．通过现代生物技术可以将重组细胞在体外培养成山羊个体

    (3)为了快速繁殖转基因山羊，还可在丁过程前对早期胚胎进行____________，经培养后再分别移植到____________________的代孕母羊的相应部位。

（1）若分离以尿素为氮源的细菌。在含有___酶的细菌菌落周围会出现，这是由于尿素被分解产生的氨气使PH升高，______指示剂产生颜色变化。采用______法将发酵菌株固定在锯末上制成固定化菌株，可大幅缩短生产周期,降低生产成本和提高生产效率。

(2)亚硝酸盐测定原理:亚硝酸盐可与________________发生重氮化反应.这一产物再与____________________偶联,形成__________色产物。

（3）获得目的基因，获取已知目的基因序列用化学方法合成或_________________

基因工程的核心:通常用_________________分别切割目的基因和载体DNA，然后用________将目的基因和载体DNA连接在一起,形成重组DNA分子。

（4）卵巢经超数排卵处理后，要使用__________________确定卵泡的位置。     

 科研人员单独培养胚胎干细胞，首先需要在培养皿底部制备一层______细胞，称为饲养层。 利用动物细胞培养技术中的细胞具有________________和__________________的特点可用烧伤患者自身的健康皮肤细胞培养出大量自身薄层皮肤细胞，用于移植。

（5）植物克隆和动物克隆共有的培养方法是_______

A.原生质体培养、传代培养     B.贴壁培养、传代培养 

C.器官培养、愈伤组织培养     D.悬浮培养、器官培

苦马豆素(SW)最早是从植物灰苦马豆中分离获得,为了研究SW是否具有抑制肿瘤细胞生长的作用,学者做了大量研究,相关实验过程及结果如下:

① 取小鼠肝癌Hepal-6细胞;

② 制成单细胞悬液,等量接种于多孔板,加入等量细胞培养液,每组设5个平行孔;

③ 于37℃、5%CO₂培养箱中培养24 h;

④ 加入等量不同浓度的SW溶液,于37℃、5%CO₂培养箱中培养;

⑤ 分别在24 h、48 h、72 h时摇匀后吸取培养液,观察并记录结果,得到不同浓度的SW对细胞存活率的影响曲线,如图所示;

⑥ 将培养48h的培养液离心,细胞染色,在荧光显微镜下观察拍照,记录癌细胞和凋亡细胞的数目,并采用免疫荧光细胞技术检测细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达量状况,汇总统计结果见下表。

培养48h后细胞数目及凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达水平

注:“+”的数量表示相对值的大小。

请回答下列问题:

(1) 实验中进行小鼠肝癌Hepal-6细胞培养的原理是____。培养箱中要有适量的无菌空气,原因是______________。肝癌细胞数量增多扩展时,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物,可能的原因是________。 

(2) 实验步骤③中“于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h”的目的是____________。 

(3) 分析图中曲线可知,SW对肝癌Hepal-6细胞的作用效果是____________________________________________。 

(4) 表中结果表明SW可以诱发细胞____,从而抑制肿瘤细胞生长。从两种蛋白质的表达水平来看,Bax蛋白和Bcl-2蛋白对癌细胞凋亡的作用分别是________。 

如图所示为动物细胞培养过程中,动物细胞增殖情况的变化曲线（图 中 B、D 两点表示经筛选后继续培养）,据图回答问题。

​

（ 1 ） OA 段 的 培 养 称 为_________________________________培 养 ， AB 段 可 能 发 生 了_______________________________现象，需要用_______________________________酶处理使组织细胞分散开来。

（2）动物细胞培养和植物组织培养过程中，就细胞增殖、分化来说，动植物细 胞都要进行_______，不同的是植物细胞还要进行____________。

（3）为制备单克隆抗体，需将_______________________________注射到小鼠体内，以此获取相 应的 B 淋巴细胞，同时可选取图中_____________________________________________________________________________________点以后的细胞与该细胞融合 形成杂交细胞。这种杂交细胞的特点是___________________________________________________________________________________________。

（4）在制备单克隆抗体的过程中，需要经过两次筛选，第一次是诱导融合之后筛选出_______________________________细胞，第二次是筛选出_______________________________细胞。

现代生物工程技术推动了医药学、免疫学和生态学的发展，如科学家将人的血清蛋白基因转入奶牛细胞中，利用牛的乳汁生产出人的血清蛋白等。

（1）从牛的组织获得单个细胞，通常需要用______________酶处理。

（2）将人血清蛋白基因导入牛的常用的方法是_______________。在导入之前，要用_____________酶构建基因表达载体，导入后再将受精卵送入母体的输卵管，受精卵即在输卵管内进行___________，开始发育。

（3）上述胚胎发育早期是在____________内进行的，这个时期称为卵裂期。在胚胎发育过程中，囊胚的___________将发育成转基因牛的各种组织。

（4）为了要泌乳，必须保证移植的胚胎为______性，一般的做法是取样_________做DNA分析性别鉴定。当转基因动物进入泌乳期时，可通过分泌的乳汁来生产人血清蛋白，因而称为_______________。

（5）单克隆抗体的制备中，将经抗原免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，再用特定的___________培养基进行筛选，获得杂交瘤细胞后，还需进行___________培养和抗体检测，经过多次筛选，就能获得能分泌单一抗体的杂交瘤细胞。最后获得的杂交瘤细胞只能产生一种单一抗体的原因是___________。

（6）为建设美丽乡村，积极推进生态农业建设，依据生态工程___________的原理，合理设计食物链，使生态系统中的物质和能量得到分层次多级利用，使废弃物资源化，提高了能量的___________，减少了环境污染。

利用小鼠制备的抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕试剂盒”，检测早孕的准确率在90%以上。请回答该“单抗”制备的有关问题：

(1)单克隆抗体与常规的血清抗体相比。最大的优越性是______________。

(2)在该“单抗”的生产过程中，将__________________作为抗原对小鼠进行注射。

(3)对小鼠注射特定抗原后，可从小鼠体内脾脏中得到相应的____________细胞，设法将鼠的骨髓瘤细胞与该细胞融合，常用诱导融合剂______________处理,再用特定的选择培养基对融合细胞进行筛选，选出的是____________；大规模培养前对该细胞还需进行细胞培养和__________检测，经多次筛选，可获得足够数量的符合需要的融合细胞。该融合细胞的特点是: _______________________。

(4)得到的杂交瘤细胞一般采用体内培养和体外培养两种方式进行培养，体外培养对环境条件的要求比较高，除了需适宜的温度和PH、一定的营养和气体条件外，还需满足的条件有：____________。

欲研究药物乙对海拉细胞增殖的抑制作用，请根据以下提供的材料与用具，以海拉细胞的细胞数变化为测定指标，完善实验分组设计和实验思路，预测实验结果并进行分析与讨论。

材料与用具：海拉细胞悬液，药物甲溶液（对细胞增殖有促进作用），药物乙溶液，培养液、培养瓶，血细胞计数板，显微镜等。

（要求与说明：细胞计数的具体操作过程不做要求，不考虑加入溶液对体积的影响，实验条件适宜）

回答下列问题：

（1）实验分组设计：

A组：海拉细胞悬液+培养液

B组：海拉细胞悬液+培养液+__________

C组：海拉细胞悬液+培养液+药物甲溶液，培养一段时间后，加入________________

（2）完善实验思路：

 ①取等量细胞悬液分别加入到含等量培养液的培养瓶中，用________________在显微镜下计数并记录

②将_______海拉细胞悬液分别加入到A、B、C三组培养瓶中进行培养

③每隔一段时间分别测定三组培养瓶中的______并记录

④当细胞增殖达一定数量时，向C组中加入药物乙溶液

⑤重复③，对所得数据进行______

（3）预测实验结果（以坐标曲线图形表示实验结果，并标出加入药物的时间）

细胞培养已经成为生物化学、医学、制药等领域研究和生产不可缺少的技术。回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_________。

(2)在动物细胞培养过程中，首先要保证无菌、无毒的环境，对培养液要进行无菌处理外，通常还要在细胞培养液中添加一定量的__________，作用是__________________。动物细胞培养还需要的其他条件是___________、____________、____________。

(3)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现____________________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成________细胞，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面的糖蛋白的量________。

(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。

骨肉瘤是最常见的恶性成骨性肿瘤之一。科研人员研究曲古抑菌A（TSA）对人骨肉瘤细胞凋亡的影响及作用机制，为临床治疗寻找新方向。实验过程如下：

步骤1 用含青霉素和链霉素的高糖培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中培养人骨肉瘤细胞一段时间。

步骤2 取适宜浓度的处于生长旺盛期的人类骨肉瘤细胞，用加入不同浓度的TSA（0～200 ng·mL^-1）的培养基继续培养24h。

步骤3 对各组细胞进行抽样检测，检测方法是先用台盼蓝试剂（一种细胞活性染料）染色再用血细胞计数板计数，统计细胞存活率（未染色细胞数/细胞总数×100%），结果如图1。

步骤4 分别提取TSA浓度为0 ng·mL^-1、25 ng·mL^-1、50 ng·mL^-1处理的3组细胞，测量细胞中与凋亡相关的基因（Bax、Bcl-2）和β-肌动蛋白基因（不同的组织细胞中表达相对恒定）表达的蛋白质量并计算比值，结果如图2。分析回答：

（1）与正常成骨细胞相比，骨肉瘤细胞容易在体内分散和转移，其主要原因是                            。高糖培养基中加入青霉素和链霉素的目的是                     ，细胞培养箱中保持5% CO₂的作用是                  。

（2）步骤2中，设置0 ng·mL^-1 TSA实验的主要目的是                         。

（3）用台盼蓝试剂检测细胞活性的主要原理是                                  。

（4）图1所示结果表明                                  。

（5）根据图2判断，骨肉瘤细胞中          基因过度表达会加速细胞凋亡。