T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T₁代）。

（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除_______________，因为后者产生的

_________会抑制侧芽的生长。

（2） 为筛选出已转化的个体，需将T₁代播种在含____________的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T₂ 代）。

（3） 为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T₂代播种在含___________的培养基上，获得所需个体。

（4）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性______。

（5）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是：提取_________植株的DNA，用限制酶处理后，再用__________将获得的DNA片段连接成环（如图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取____________作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。

嗜热菌可以生活在98℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA^↓TATG、G^↓AATTC、A^↓AGCTT、G^↓TCGAC。请分析回答：

(1)图中的结构A是________，其主要作用是________。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有________。

(2)用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有________(多选)。

①反应温度 ②缓冲液pH ③限制酶的浓度 ④DNA样品的纯度

(3)实验中发现，重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加________，整个实验过程应保持________操作。

(4)PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是________。

A.引物Ⅰ：···GGGAATTC···；引物Ⅱ：···CTCATATG···

B.引物Ⅰ：···GAATTCCC···；引物Ⅱ：···CATATGAG···

C.引物Ⅰ：···GGAAGCTT···；引物Ⅱ：···AAGCTTCC···

D.引物Ⅰ：···CTCATATG···；引物Ⅱ：···AAGCTTAAGCTT···

含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对DNA分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题

（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是从                生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是                （填“基因组文库”,“cDNA文库”或“基因组文库”和“cDNA文库”）

（2）含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源DNA，但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有①                ；②                。

（3）利用PCR扩增目的的基因的过程由高温变性（90~95°C）,低温复性（55~60°C），适温延伸（70~75°C）三个步骤构成一个循环，为使得DNA聚合酶能够重复利用，选用的酶应在                °C处理后仍然具备催化活性。

（4）在PCR扩增目的基因时，为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记，反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的                （填“腺嘌呤核糖核苷酸”，“dATP”或“ATP”）.

图1

(1) 过程②中常用____技术将目的基因导入受精卵,受精过程中精子头部接触卵细胞膜时产生____反应,以防止多精入卵。 

(2) 过程⑤在精核与卵核融合之前,用微型吸管吸除雄核,再用细胞松弛素B处理(作用类似于用秋水仙素处理植物细胞),处理后的受精卵可发育成猕猴。这种方法在动物新品种选育中的显著优点是_________________。 

(3) ⑦过程通过____技术实现,在个体水平上检测GFP基因是否表达的方法是______________。 

(4) 胚胎工程中通常需要鉴定胚胎性别,如利用SRY—PCR技术鉴定,鉴定时需以Y染色体上的SRY基因(性别决定基因)的一段序列设计引物,用被测胚胎DNA作模板进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20~24个核苷酸,其不宜过短的原因主要是_。 

图2　　　　　　　　　　　　

人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值。科研人员通过生物工程技术获得转HSA基因母牛，以便通过乳腺生物反应器生产HSA，其主要技术流程如下图所示。回答下列问题：

(1)如上图所示，将牛胎儿成纤维细胞核移入去核卵母细胞中，该技术称为_______________技术；供核的牛胎儿成纤维细胞通常选用传代10代以内的细胞，其原因是____________________________________________________。

(2)胚胎移植时，为使代孕母牛能处于适合的生理状态，需要用激素对其进行_______处理。

(3)SRY～PCR法性别鉴定的基本程序是：提取牛胎儿成纤维细胞的DNA，经PCR反应体系扩增SRY基因(Y染色体上特有的性别决定基因)片段，然后对扩增产物进行检测。

①PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有______________；其中，dNTP的作用是___________________，引物应选用下图中的_________(填图中标号)。

②若扩增产物含大量SRY基因片段，则该种牛胎儿成纤维细胞________(选填“能”或“不能”)用作技术流程中转化过程的受体细胞。

(4)从细胞水平鉴定早期胚胎性别的方法是_______________。

嗜热菌可以生活在98 ℃的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA^↓TATG、G^↓AATTC、A^↓AGCTT、G^↓TCGAC。请分析回答：

(1) 图中的结构A是__________，其主要作用是提供_______________特异性识别结合位点，驱动基因转录。一个完整的基因表达载体的组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有______________。

(2) 用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用__________两种限制酶进行切割

(3) 将重组质粒导入大肠杆菌细胞之前，一般需先用______溶液处理大肠杆菌，以便将基因表达载体导入细胞。重组质粒导入大肠杆菌后H基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加__________，整个实验过程应保持____________操作。

(4) PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是________。

A. 引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…

B. 引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…

C. 引物Ⅰ：…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…

D. 引物Ⅰ：…CTCATATG…；引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…

某实验小组以洋葱组织为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定的实验，实验主要过程如下图，回答下列问题：

（1）步骤一中需加入一定量的洗涤剂和    对洋葱组织进行处理，加入前者是的目的是               ，加入后者的目的是            。将搅拌和研磨后的物质进行过滤，即可得到含有DNA的滤液。

（2）步骤二是DNA纯化过程中的关键步骤，可以采用以下几种不同的方法：

①滤液中NaCl浓度在      mol／L时可分离出DNA，若要再次提纯，需要将其溶解在2mol／L的NaCl溶液中；

②通常会向DNA粗提取物中加入嫩肉粉，其目的是         ；

（3）步骤三中向滤液中加入DNA体积分数为95%的酒精的目的是___     _，得到纯净的DNA后，可利用DNA与            在沸水浴条件下会被染成    色，来对其进行鉴定。

（4）提取出的DNA继续进行PCR，一般经过    次循环，每次循环经过     、            、       三步。

基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作物的性状。通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分。多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR技术。请回答：

（1）我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得     、     、延熟的转基因作物。

 （2）引物是根据           的一段核苷酸序列合成的，每种基因扩增需要一对引物的原因是                                       。下表是A、B、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要在                            。

（3）PCR过程中温度从90℃降到55-60℃的目的是                          。

（4）检测人员通过多重PCR技术确定农作物中是否含有A、B、C三种转基因。将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图。

 据图分析：含有三种转基因的农作物是____    ，判断依据是                                            。

 （5）与PCR技术相比，多重PCR技术的优势                             。  

如图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：

（1）图中cDNA文库______基因组文库（填“大于”、“等于”或者“小于”）．

（2）（2）①过程提取的DNA需要__________的切割．

（3）（3）为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是___________．

（4）（4）目的基因获取之后，需要进行_________，其组成，必须有_________、________、_______以及标记基因等．此步骤是基因工程的核心．